Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline
Summary
Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.
Abstract
Die Montage von Mikrokristallen (<10 μm) für die einkristalline Kryokristallographie stellt eine nicht triviale Herausforderung dar. Verbesserungen in der Datenqualität wurden für Mikrokristalle mit der Entwicklung von Beamline-Optiken, Strahlstabilität und variabler Strahlgrößenfokussierung von Submikron bis Mikrometer beobachtet, wie bei der VMXm-Beamline an der Diamond Light Source1. Weitere Verbesserungen der Datenqualität werden durch Verbesserungen der Probenumgebung und der Probenvorbereitung erzielt. Mikrokristalle erzeugen von Natur aus eine schwächere Beugung, daher ist die Verbesserung des Signal-Rauschens der Schlüssel zur Erfassung hochwertiger Röntgenbeugungsdaten und wird hauptsächlich durch die Verringerung des Hintergrundrauschens entstehen. Hauptquellen für Röntgenhintergrundgeräusche in einem Beugungsexperiment sind ihre Wechselwirkung mit dem Luftweg vor und nach der Probe, überschüssige Kristallisationslösung, die die Probe umgibt, das Vorhandensein von kristallinem Eis und Streuung von anderen Beamline-Instrumenten oder Röntgenfenstern. Die VMXm-Beamline umfasst Instrumentierung und ein Probenvorbereitungsprotokoll, um all diese Rauschquellen zu reduzieren.
Erstens entfernt eine In-Vakuum-Probenumgebung bei VMXm den Luftweg zwischen Röntgenquelle und Probe. Als nächstes verwenden Probenvorbereitungsprotokolle für die makromolekulare Kristallographie bei VMXm eine Reihe von Prozessen und Werkzeugen, die von kryoTEM angepasst wurden. Dazu gehören Kupfergitter mit löchrigen Kohlenstoffträgerfolien, automatisiertes Blotting und Tauchkühlrobotik unter Verwendung von flüssigem Ethan. Diese Werkzeuge ermöglichen die Herstellung von Hunderten von Mikrokristallen auf einem einzigen KryoTEM-Gitter mit minimaler Umgebungsflüssigkeit auf einer geräuscharmen Unterstützung. Sie minimieren auch die Bildung von kristallinem Eis aus der verbleibenden Flüssigkeit, die die Kristalle umgibt.
Wir stellen das Verfahren zur Vorbereitung und Beurteilung der Qualität löslicher Proteinmikrokristalle mit sichtbarem Licht und Rasterelektronenmikroskopie vor, bevor die Proben für Röntgenbeugungsexperimente auf die VMXm-Beamline montiert werden. Wir werden auch Beispiele für qualitativ hochwertige Proben sowie solche, die weitere Optimierungen und Strategien erfordern, zur Verfügung stellen.
Introduction
Eine wesentliche Barriere für die Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Moleküle mittels makromolekularer Kristallographie (MX) bleibt die Herstellung von gut beugenden Kristallen in einer erschwinglichen Größe. Es gibt viele Strategien, um dieses Ziel zu erreichen, vom design rekombinanter Proteingenkonstrukte bis hin zu großen spärlichen Matrixsuchen nach chemischen Cocktails, die anfängliche Kristalle erzeugen können2. Bei letzterem ist es oft der Fall, dass der Kristallograph anfängliche Treffer optimieren muss, um Kristalle mit ausreichender Beugungsqualität und -größe für Strukturbestimmungsstudien zu erhalten3. Trotz dieser Optionen können einige Zielmoleküle niemals große (>10 μm), gut beugende Kristalle erzeugen, und infolgedessen muss der Kristallograph mit seinen Mikrokristallen und den Herausforderungen, die solche Proben darstellen, durchhalten. Dazu gehören die angemessene Montage und der Kryoschutz der Kristalle, die Behandlung einer von Natur aus schwächeren Beugung und eine erhöhte Strahlungsempfindlichkeit. Mikrokristalle werden aus weniger Einheitszellen und Molekülen gebildet als größere Kristalle und als solche wird die Beugung im Vergleich zu größeren Kristallen nicht im gleichen Maße verstärkt, was zu inhärent schwächeren Beugungsdichten führt. Es ist wichtig, dass das Hintergrundsignal diese Reflexionen nicht maskiert, insbesondere bei höherer Auflösung, wo schwache Reflexionsdichten verloren gehen können4. Darüber hinaus sind Mikrokristalle empfindlicher gegenüber Strahlungsschäden und trotz der Aufzeichnung der Beugung bei Flüssigstickstofftemperaturen 5 ist es möglicherweise nicht möglich, vollständige Daten voneinemEinkristall zu sammeln, so dass es notwendig ist, Daten von einer sehr großen Anzahl von Kristallen zu sammeln, um einen einzigen vollständigen Datensatz zu erstellen6.
Die zunehmende Verfügbarkeit von Röntgenlasern für freie Elektronen (XFELs) und die Entwicklung serieller Kristallographiemethoden (SFX)7 haben Wege zur Datenerfassung von kleineren Mikrokristallen geschaffen. Dies sind jedoch maßgeschneiderte Probenabgabemethoden, die ein erhebliches Maß an Hardware- und Software-Know-how erfordern, bei denen Experimente auf Raumtemperatur beschränkt sind und der Probenverbrauch in der Regel hoch ist (Hunderte von Mikrolitern) und dennoch weitere Optimierungen erfordern kann8. Daher sind Projekte, bei denen nur eine begrenzte Menge an Mikrokristallen hergestellt werden kann, für SFX nicht geeignet.
In der Zwischenzeit hat sich die Synchrotron-Beamline-Technologie in den letzten Jahrzehnten weiterentwickelt, um kleinere, stabilere Strahlen9 mit einer Brillanz zu erzeugen, die die Datenerfassung von immer kleineren Kristallen ermöglicht hat10,11. Mikrofokus-Beamlines wie FMX bei NSLS-II und I24 bei Diamond Light Source konnten neuartige Strukturen aus Kristallen mit maximalen Abmessungen von ~3 μm12 bestimmen und die Fähigkeit demonstrieren, nutzbare Daten von noch kleineren Kristallen mit einer Größe von ~1 μm13zu sammeln. Die Beamline muss präzise konfiguriert sein, mit einer exzellenten, hochauflösenden On-Axis-Betrachtungsoptik, einer minimalen Verwechslungskugel für die Probenrotation und einer präzise ausgerichteten Rotationsachse, die mit dem Röntgenstrahl zusammenfällt. Es ist wichtig, das Röntgenstrahlprofil eng an das Kristallvolumen anzupassen und sicherzustellen, dass der Kristall im Röntgenstrahl präzise ausgerichtet ist – eine Herausforderung für Kristalle <5 μm14. Die Erfüllung dieser experimentellen Bedingungen an der Beamline ist unerlässlich, um Daten von Mikrokristallen in bester Qualität aufzuzeichnen.
Der verbleibende und möglicherweise wichtigste Aspekt der Datenerhebung aus Mikrokristallen ist die Präsentation des Kristalls zum Röntgenstrahl. Mikrokristalle wurden oft auf Micromesh-Probenhalterungen montiert, die aus Polyimid hergestellt wurden, einem Röntgenstreumaterial mit Aperturen von nur 10 μm15,16. Das Polyimid-Netz ist auf einem Standardstift montiert, der in eine magnetische SPINE-Basis eingelegt ist, wodurch es mit den meisten MX-Beamlines17kompatibel ist. Die Mesh-Halterung wird verwendet, um Kristalle aus dem Kristallisationstropfen zu fischen, oft nach dem gleichen Verfahren wie die Montage eines 100-μm-Kristalls mit einer Standard-Loop-Mount. Während die Kristalle über das Netz verteilt sein können, besteht ein wesentlicher Nachteil darin, dass während der Ernte ein relativ großes Flüssigkeitsvolumen durch das Netz und den Stift getragen werden kann (Abbildung 1C, D). Dieses Flüssigkeitsvolumen, das um ein Vielfaches größer sein kann als die Kristalle selbst, trägt bei Röntgenstrahlen zu Hintergrundgeräuschen bei. Diese Hintergrundstreuung kann noch stärker sein, wenn die Flüssigkeit während der Blitzkühlung kristallines Eis bildet, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis bereits schwacher Dichten innerhalb der Auflösungen der Eisbeugung verringert wird. Daher ist es wichtig, dass überschüssige Flüssigkeit aus der Probe entfernt wird, um sicherzustellen, dass alle möglichen Signale aufgezeichnet werden können. Diese Herausforderung ist noch größer bei Membranproteinkristallen, die innerhalb der lipidkubischen Phase (LCP) gebildet werden, wo das LCP eine starke Hintergrundstreuung erzeugt und auch schwer aus den Kristallen entfernt werden kann 18.
Die neue Versatile Macromolecular Crystallography Microfocus (VMXm) Beamline an der Diamond Light Source bietet die Voraussetzungen, um Daten von Kristallen zu sammeln, die möglicherweise weniger als einen Mikrometer groß sind. Die Beamline wurde entwickelt, um ein Strahlprofil von 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, ein Goniometer mit einer Verwirrungskugel von nicht mehr als 60 nm und eine Probenumgebung im Vakuum zu liefern. Diese Konstruktionsmerkmale der VMXm-Endstation minimieren die Erzeugung von Hintergrundröntgenrauschen durch die Beamline-Apparatur während der Datenerfassung mit der größten verbleibenden Hintergrundquelle, die von der Probe erzeugt wird14.
Spezifische Probenvorbereitungsmethoden, die für die VMXm-Beamline entwickelt wurden, bieten die Möglichkeit, diesen Hintergrund zu reduzieren und das Signal-Rauschen von Beugungsdaten weiter zu verbessern, wodurch die Qualität der Daten maximiert wird, die von Mikrokristallen mit einer Messung von <10 μm aufgezeichnet werden können. Viele der hier beschriebenen Anforderungen an die Low-Background-Beugung von Mikrokristallen sind auch für die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (CryoTEM)19 und die Mikrokristall-Elektronenbeugung (microED)20üblich. Infolgedessen eignen sich viele der Werkzeuge, die bereits für die Vorbereitung von KryoTEM-Proben entwickelt wurden, mit einigen Anpassungen für die Herstellung von Mikrokristallen. Bei der Vorbereitung von Proben für Einzelpartikel-KryoTEM werden die untersuchten Partikel in sehr dünne Schichten (typischerweise <100 nm) aus Glaseis eingebettet, so dass Elektronen durch die Probe übertragen können. Die dünne gleichmäßige Schicht wird durch Abtränken überschüssiger Flüssigkeit erreicht und die Vitrifizierung der Probe wird durch schnelles Abkühlen der Probe (~104 Ks-1)21durch Eintauchen in flüssiges Ethan erreicht, das bei ~93K22gehalten wird. Im Gegensatz dazu ist flüssiger Stickstoff, wie er routinemäßig für die MX-Probenvorbereitung verwendet wird, ein weniger effizientes Kryogen als Ethan und hat eine größere Neigung zur kristallinen Eisbildung innerhalb der Probe21. Die Bildung von kristallinem Eis, das die Beugung abbauen und Hintergrundgeräusche erzeugen kann, wird normalerweise durch den Einsatz von kryoschützenden Verbindungen gemildert23. Niedermolekulare Polymere wie Polyethylenglykol (PEG) 400 und Methyl-2,4-pentandiol (MPD), Zucker, Öle oder gesättigte Salze können einer aliquoten Kristallisationslösung in niedrigen Konzentrationen zugesetzt werden24– es gibt keine “Einheitslösung” für die Auswahl des am besten geeigneten Kryoprotektivums und dies erfordert oft eine Optimierung25 . Der Kristall durchläuft auch mehrere Manipulationen während des Ernte- und Kryoschutzprozesses, die zu einer Schädigung des Kristalls führen können, die Möglichkeit, flüssiges Ethan zu verwenden, ermöglicht das Weglassen dieses Schritts und trägt zum Schutz der Integrität des Kristalls bei.
Während flüssiges Ethan aufgrund der Dünnheit der Probe ein wirksames Kryogen für Mikrokristalle (<10 μm) ist, gibt es alternative Methoden zur Verhinderung der Kristalleisbildung, insbesondere in größeren Kristallen, einschließlich der Verringerung des Wassergehalts des Kristalls durch Verwendung einer streng kontrollierten feuchten Umgebung26oder durch den Ableitung überschüssiger Flüssigkeit weg von der Schleife und Oberfläche des Kristalls27 Diese erfordern jedoch wiederum eine stärkere Manipulation der Probe. Die Verwendung von automatisiertem Blotting und Tauchgefrieren mit flüssigem Ethan, wie in KryoTEM, entfernt zusammen überschüssige Kristallisationslösung und bietet ein Mittel, um Kühle von Mikrokristallen auf kontrollierte Weise zu blitzen, während versucht wird, Manipulationen zu minimieren.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nicht nur von Benutzern der VMXm-Beamline und an anderen Mikrofokus-Beamlines verwendet werden kann, um daten mit hoher Signal-Rausch-Beugung zu sammeln, sondern auch für diejenigen nützlich sein kann, die lösliche Proteinkristall- und waschmittelbasierte Membranproteinkristallproben für microED-Experimente herstellen. Während bei VMXm alle Einrichtungen zur Vorbereitung und Bewertung von Proben zur Verfügung stehen, sind viele strukturbiologische Labore zunehmend für die KryoTEM-Probenvorbereitung ausgestattet. Infolgedessen gehen wir davon aus, dass einige Benutzer ihre eigenen Einrichtungen nutzen möchten, um ihre Proben für die Strahlzeit bei VMXm vorzubereiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zeigt, wie Werkzeuge aus der cryoTEM-Probenvorbereitung zur Herstellung von Mikrokristallen für Röntgenbeugungsexperimente an Mikrofokus-Beamlines eingesetzt werden können. Die Standard-Beamline-Instrumentierung ist um eine an einem Pin montierte Probe zentriert, und obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um eine Probenunterstützung auf diesen Halterungen für Mikrokristalle bereitzustellen, sind sie oft schwierig, sie mit der Probe zu laden, während sichergestellt wird, dass das höchste Signal-Rauschen erreicht wird (Abbildung 1C, D). Viele dieser Proben erfordern möglicherweise auch eine Optimierung der Kryoschutzbedingungen, um sicherzustellen, dass die Probe glasig ist. Das Tauchgefrierverfahren bietet eine wiederholbare Möglichkeit, überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und die Probe in einem effizienten Kryogen zu kühlen (Abbildung 1A, B). Während das Gitter dann auf einer Standard-Beamline mit einer Pinzettenhalterung montiert werden kann, wurden VMXm-Probenhalter speziell entwickelt, um Gitter aufzunehmen und sie in einer Vakuumumgebung durch leitfähige Kühlung unter der Glasübergangstemperatur zu halten. Die Beispielumgebung von VMXm ermöglicht eine geringe Hintergrunddatenerfassung, bei der die Probe die verbleibende Hintergrundquelle ist, und bietet einen Mikrostrahl, mit dem Kristalle mit Abmessungen von weniger als 10 μm abgegleicht werden können. Diese Probenvorbereitungsmethode kann auch zur Vorbereitung von Nanokristallen für die Elektronenbeugung verwendet werden, wo aufgrund des schwachen Eindringens von Elektronen auch sehr wenig überschüssige Flüssigkeit und eine Glaskörperprobe erforderlich sind. Während CryoTEM-Gitter zerbrechlich sind, werden sich diejenigen, die Erfahrung mit der Ernte von Kristallen in Schleifen haben, schnell an die Handhabung der Gitter anpassen. Mit ein wenig Erfahrung gehen während der Lösch-, Einfrier- und Ladephasen des Protokolls nur wenige Gitter verloren. Die Optimierungsschritte sind jedoch entscheidend für diesen Erfolg und eine sorgfältige Vorbereitung verringert die Wahrscheinlichkeit, Kristalle zu verlieren oder die Kristallintegrität zu verringern.
CryoTEM-Gitter bieten eine relativ große Einzelhalterung, die viele hundert Kristalle enthalten kann, wodurch der Durchsatz verbessert wird, wo es möglicherweise nur möglich ist, einen kleinen Keil beugungsdaten aufzuzeichnen. Ein einzelnes Gitter kann auch genügend Kristalle liefern, um die Proteinstruktur zu bestimmen, insbesondere in Kristallen mit hoher Symmetrie. Wenn nur ein oder zwei Einkristallisationstropfen Mikrokristalle erzeugt haben, kann allein das Versuchslöschen der Kristallisationsbedingung dazu beitragen, dass beim Blotten der Mikrokristalle die verwendeten Zeiten so nahe wie möglich an denen liegen, die zur Erzeugung anfänglicher Proben guter Qualität erforderlich sind. Die Carbonfilmträger sind für Röntgenstrahlen unsichtbar und mit unterschiedlichen Lochabständen erhältlich, die für eine bestimmte Morphologie verwendet werden können. Am häufigsten verwenden wir Stützfolien mit 2 μm-Löchern in einem Abstand von 2 μm, aber kleinere Löcher mit größerem Abstand können für Kristalle kleiner als 2 μm besser geeignet sein. Andere Trägerfolien wie solche mit 1 μm-Löchern mit einem Abstand von 4 μm sowie Trägerfolien mit unterschiedlich geformten Löchern sind verfügbar, die sich alle auf die Löschzeit auswirken. Eine Rasterquadratmaschenöffnung von 200 (200 Quadrate pro Zoll) bietet auch genügend Platz (~ 100 μm) zwischen den Kupfergitterstäben, so dass der Röntgenstrahl nicht stark mit dem Kupfer interagiert und gleichzeitig genügend strukturelle Unterstützung für den mit Kristallen beladenen Kohlenstofffilm bietet. Die Verwendung von flüssigem Ethan macht Kryoprotektoren zunichte, was wiederum den Bedarf an Probenvolumen reduziert, das bei der Optimierung der Kryoprotektorenbedingungen verwendet worden wäre.
Die wichtigsten Parameter, die während des Prozesses optimiert werden müssen, sind die Löschzeiten und die Probenverdünnung. Die Blotting-Zeiten sollten lang genug sein, um den “Popping” -Effekt über das gesamte Gitter zu beobachten, bevor sie einfrieren. Überblotting könnte zur Austrocknung der Kristalle führen, jedoch wird die Kontrolle der Feuchtigkeit innerhalb der Probenkammer verwendet, um diesen Effekt zu minimieren. Während vorgeschlagen wird, dass eine relative Luftfeuchtigkeit von 90% verwendet wird, können einige Proben bei der Optimierung der Luftfeuchtigkeit profitieren. Die Feuchtigkeit kann die Löscheffizienz des Löschpapiers beeinträchtigen, das langsam mit Wasser gesättigt werden kann. Zusätzlich könnte die Feuchtigkeitskontrolle innerhalb der Probenkammer verwendet werden, um die Beugungsqualität der Kristalle zu verbessern30. Es wird empfohlen, vor der Überprüfung der Beugungsintegrität kleine Änderungen (<5%) der Luftfeuchtigkeit vorzunehmen, um sicherzustellen, dass die Beugungsqualität nicht beeinträchtigt wird.
Die Optimierung von nicht wertvollen Proben kann mit einem Lichtmikroskop anstelle eines REM durchgeführt werden. Obwohl es destruktiv ist, ist es nützlich, um die Dichte von Kristallen über das Gitter zu beurteilen und die Entscheidung darüber zu ermöglichen, ob eine Probe verdünnt oder konzentriert werden soll, um Kristalle besser über das Gitter zu dispergieren. Dieser Schritt ist am nützlichsten, wenn eine große Anzahl von Kristallen und besonders hochkonzentrierte Proben zur Verfügung stehen. Ein Zusammenklumpen von Kristallen sollte vermieden werden (Abbildung 3), da es zwar kein signifikantes Problem darstellt, wenn zwei Kristalle während der Datenerhebung6gleichzeitig beleuchtet werden, aber wahrscheinlich ein größeres Flüssigkeitsvolumen um den Klumpen herum vorhanden ist, wodurch das Signal-Rausch-Rauschen verringert wird (Abbildung 5). Während es möglich ist, große Flüssigkeitsexzesse global über das Gitter mit einem Lichtmikroskop zu beobachten, kann die Beurteilung des Flüssigkeitsvolumens, das die Mikrokristalle umgibt, und des Vorhandenseins von kristallinem Eis nur mit einem Elektronenmikroskop erfolgen, das mit einem kryogenen Vakuumtransfersystem und einer Kryostufe ausgestattet ist. Manchmal, nach dem Auftragen der Kristalle auf das Gitter und bevor es zu Blotting kommt, können sich Kristalle in niedrigviskosen Lösungen entlang einer Kante des Gitters absetzen. Wir haben festgestellt, dass die Zugabe einer Endkonzentration von Ethylenglykol von bis zu 50% die Bewegung von Kristallen durch das Tröpfchen verlangsamen kann, was eine bessere Verteilung der Mikrokristalle über das Gitter gewährleistet und eine bessere Kontrolle über das Blotting durch Erhöhung der Blotting-Zeit bietet (Abbildung 3D).
Einige Kristallisationslösungen, die viskose Fällungsmittel wie PEGs mit hohem Molekulargewicht enthalten, können sich als schwierig zu bloten erweisen und erfordern immer längere Löschzeiten (>10 s). In solchen Fällen kann es hilfreich sein, das Volumen der auf der Rückseite des Gitters abgelagerten Flüssigkeit sowie das Volumen der Kristalllösung auf der Trägerfilmseite des Gitters zu reduzieren. Strategien wie die Verwendung von 2 Schichten Löschpapier oder Glasfasern können in diesen schwierigen Fällen auch das Blotting unterstützen31.
Während diese Pipeline für lösliche Proteinkristalle geeignet ist, stellen diejenigen, die sich in sehr viskosen Medien wie Membranproteinen in LCP bilden, eine andere Herausforderung dar, für die dieses Protokoll nicht geeignet ist. Es entstehen jedoch Strategien zur Herstellung von LCP-Kristallen auf KryoTEM-Gittern für microED, die die Verringerung der Viskosität der Proben durch Induktion einer Phasenänderung des LCP beinhalten. Auf diese Weise können die Beispiele auf raster in ähnlicher Weise wie in diesem Artikel beschrieben angewendet werden. Schließlich kann die Probe mit einem fokussierten Ionenstrahl gefräst werden, um überschüssiges nichtkristallines Material32,33,34zu entfernen.
Insgesamt dauert diese Pipeline in der Regel 1-2 Stunden (einschließlich der Einrichtungszeit der Ausrüstung), von der Probe, die bei VMXm ankommt, bis zur Bereitstellung optimierter Gitter mit gut dispergierten, verglasten Proben, abhängig von der Probenverfügbarkeit, der Konzentration der Kristalle und der Viskosität der Kristallisationslösung. Diese Methoden wurden bereits erfolgreich zur Herstellung von Mikrokristallen für Röntgenbeugungsexperimenteeingesetzt,bei denen Strahlungsschäden an Mikrokristallen untersucht wurden, bei denen ein minimales Flüssigkeitsvolumen, das die Probe umgibt, unerlässlich war28,35. Es sollte beachtet werden, dass das Protokoll auf alle löslichen Mikrokristallproben angewendet werden kann, nicht nur auf gut beugte Proben, die bereits optimiert wurden. Ein Kristallisationsexperiment, das mikrokristallines Material erzeugt, wäre traditionell ein Ziel für die Optimierung mit dem Ziel, größere Kristalle zu erhalten, aber diese Probenvorbereitungsmethode und die Fähigkeiten von VMXm können es ermöglichen, angemessene Daten aus solchen Proben ohne weitere Optimierung zu sammeln. Alternativ, wenn solche mikrokristallinen Proben schlecht streuen, könnten die von VMXm mit dieser Probenvorbereitungsmethode gesammelten Daten immer noch als nützlicher Leitfaden für die weitere Optimierung der Kristallisationsbedingungen dienen. Die Werkzeuge zur Vorbereitung von Gittern, einschließlich Glühentladung und Tauchgefrieren, sind jetzt in Forschungsinstituten, die für KryoTEM-Experimente ausgestattet sind, weit verbreitet und werden vielen Benutzern zur Verfügung stehen, so dass sie Proben vor der Strahlzeit bei VMXm vorbereiten können.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton und Dave Stuart, STRUBI University of Oxford und Rachel Bolton, University of Southampton für die freundliche Bereitstellung von Mikrokristallproben für die Entwicklung und Demonstration von Probenvorbereitungsmethoden für die VMXm-Beamline sowie für die Inbetriebnahme der Beamline. Die Autoren danken auch iNEXT-Discovery (Projektnummer 871037) für die Möglichkeit und Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Manuskripts.
Materials
| Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
| Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
| Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
| CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
| CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
| ddH2O | n/a | n/a | |
| Ethane gas supply | n/a | n/a | |
| Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
| Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
| Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
| Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
| Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
| Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
| Pipette tips | Various | Various | |
| Pipetting devices | Various | Various | |
| Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
| Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
| Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
| Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |
References
- Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
- McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
- Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
- Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
- Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
- Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
- Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
- Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
- Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
- Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
- Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
- . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
- Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
- Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
- Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
- Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
- Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
- Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
- Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).
