JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

Published: June 17, 2021
doi:
10.3791/62306
, , , , , ,
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council,Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Verilerin sinyal-gürültü oranı, mikrokristallerden X-ışını kırınım ölçümlerinin yapılmasında en önemli hususlardan biridir. VMXm kiriş çizgisi, bu tür deneyler için düşük gürültülü bir ortam ve mikrobülans sağlar. Burada, VMXm ve diğer mikro odak makromoleküler kristalografi kiriş hatları için mikrokristallerin montajı ve soğutulmasından dolayı örnek hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz.

Abstract

Tek kristal kriyo-kristalografi için mikrokristallerin (<10 μm) montajı önemsiz olmayan bir zorluk sunar. Veri kalitesinde iyileşmeler, elmas ışık kaynağı1’dekiVMXm kiriş hattında olduğu gibi, altkondan mikronlara odaklanan beamline optikleri, ışın stabilitesi ve değişken ışın boyutunun geliştirilmesi ile mikrokristaller için görülmüştür. Örnek ortamdaki iyileştirmeler ve numune hazırlama ile veri kalitesinde daha fazla iyileştirme elde edilecektir. Mikrokristaller doğası gereği daha zayıf kırınım oluşturur, bu nedenle sinyalden gürültüye iyileştirmek, kaliteli X-ışını kırınım verilerini toplamanın anahtarıdır ve ağırlıklı olarak arka plan gürültüsündeki azalmalardan kaynaklanacaktır. Bir kırınım deneyindeki önemli X-ışını arka plan gürültüsü kaynakları, numuneden önce ve sonra hava yolu ile etkileşimlerinden, numuneyi çevreleyen aşırı kristalizasyon çözeltisinden, kristal buzun varlığından ve diğer ışın çizgisi enstrümantasyonlarından veya X-ışını pencerelerinden saçılmalarından kaynaklanmaktadır. VMXm kiriş çizgisi, tüm bu gürültü kaynaklarını azaltmak için enstrümantasyon ve örnek bir hazırlama protokolünden oluşur.

İlk olarak, VMXm’deki vakum içi numune ortamı, X-ışını kaynağı ile numune arasındaki hava yolunu kaldırır. Daha sonra, VMXm’deki makromoleküler kristalografi için örnek hazırlama protokolleri kriyoTEM’den uyarlanmış bir dizi işlem ve araç kullanır. Bunlar arasında delikli karbon destek filmlerine sahip bakır ızgaralar, sıvı etandan kullanan otomatik şişirme ve dalma soğutma robotları bulunur. Bu araçlar, düşük gürültülü bir destekte minimum çevreleyen sıvı ile tek bir kriyoTEM ızgarası üzerinde yüzlerce mikrokristal hazırlanmasını sağlar. Ayrıca kristalleri çevreleyen kalan sıvılardan kristal buz oluşumunu en aza indirirler.
X-ışını kırınım deneyleri için numuneleri VMXm kiriş çizgisine monte etmeden önce görünür ışık kullanarak çözünür protein mikrokristallerinin kalitesini hazırlama ve değerlendirme ve elektron mikroskopisini tarama sürecini sunuyoruz. Ayrıca, daha fazla optimizasyon ve strateji gerektiren numunelerin yanı sıra kaliteli örnekler de sunacağız.

Introduction

Makromoleküler kristalografi (MX) ile biyolojik moleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının belirlenmesi için önemli bir engel, uygun boyutta iyi dağınık kristallerin üretimi olmaya devam etmektedir. Rekombinant protein gen yapısı tasarımından, ilk kristalleri üretebilecek kimyasal kokteyller için büyük seyrek matris aramalarına kadar bu hedefe ulaşmak için birçok strateji vardır2. İkincisi için, genellikle kristalograficinin yapı belirleme çalışmaları için yeterli kırınım kalitesine ve boyutuna sahip kristalleri elde etmek için herhangi bir ilk vuruşu optimize etmesi gerekecektir3. Bu seçeneklere rağmen, bazı hedef moleküller asla büyük (>10 μm), iyi dağınık kristaller üretmeyebilir ve sonuç olarak kristalografici mikrokristalleri ve bu tür örneklerin sunduğu zorluklarla sebat etmelidir. Bunlar arasında kristallerin uygun şekilde montajı ve kriyo koruması, doğası gereği daha zayıf kırınım ve artan radyasyon duyarlılığının yönetilmesi saydır. Mikrokristaller daha büyük kristallerden daha az birim hücre ve molekülden oluşur ve bu nedenle kırınım, daha büyük kristallere kıyasla aynı ölçüde yükseltilmez ve bu da doğası gereği daha zayıf kırınım yoğunluklarına neden olur. Arka plan sinyalinin bu yansımaları maskelemmesi önemlidir, özellikle zayıf yansıma yoğunluklarının kaybedilebileceği daha yüksek çözünürlükte4. Ek olarak, mikrokristaller radyasyon hasarına karşı daha hassastır ve sıvı azot sıcaklıklarında kırınım kaydetmesine rağmen5, tek bir kristalden tam veri toplamak mümkün olmayabilir, bu da tek bir tam veri kümesi üretmek için çok sayıda kristalden veri toplamayı gerekli kılar6.

X-ışını içermeyen elektron lazerlerinin (XFEL’ ler) artan kullanılabilirliği ve seri kristalografi yöntemlerinin (SFX)7’nin evrimi, daha küçük mikrokristallerden veri toplamak için yollar sağlamıştır. Bununla birlikte, bunlar, deneylerin oda sıcaklığıyla sınırlı olduğu ve tipik olarak numune tüketiminin yüksek olduğu (yüzlerce mikrolitre) ve yine de daha fazla optimizasyon gerektirebileceği önemli miktarda donanım ve yazılım uzmanlığı gerektiren ısmarlama numune teslim yöntemleridir8. Bu nedenle, sadece sınırlı miktarda mikrokristal yapılabilen projeler SFX için uygun değildir.

Bu arada, senkrotron kiriş hattı teknolojisi son yıllarda daha küçük kristallerden veri toplanmasına izin veren bir parlaklığa sahip daha küçük, daha kararlı kirişler9 üretmek için ilerledi10,11. NSLS-II’deki FMX ve Diamond Light Source’daki I24 gibi mikro odaklama kiriş hatları, maksimum ~3 μm12 boyutlarında kristallerden yeni yapılar belirleyebilmiş ve ~1 μm13ölçülerinde daha küçük kristallerden kullanılabilir veri toplama yeteneğini gösterebilmiştir. Işın çizgisi, mükemmel, yüksek çözünürlüklü eksen görüntüleme optikleri, numune dönüşü için minimum bir karışıklık alanı ve X-ışını ışını ile çakışan hassas bir şekilde hizalanmış bir dönüş ekseni ile hassas bir şekilde yapılandırılmalıdır. X-ışını ışını profilini kristal hacmiyle yakından eşleştirmek ve kristalin X-ışını ışınında hassas bir şekilde hizalanmasını sağlamak önemlidir – kristaller için bir zorluk <5μm 14. Bu deneysel koşulların kiriş hattında karşılanması, mikrokristallerden en kaliteli verileri kaydetmek için gereklidir.

Mikrokristallerden veri toplamanın kalan ve muhtemelen en önemli yönü kristalin X-ışını ışınlarına sunulmasıdır. Mikrokristaller genellikle poliimidden üretilen mikromesh numune montajlarına monte edilmiştir, 10 μm 15,16kadar küçük diyaframlara sahip düşük bir X-ışını saçılma malzemesi. Poliimid ağ, manyetik bir SPINE tabanına yerleştirilmiş standart bir pime monte edilir ve çoğu MX kiriş çizgisi17ile uyumludur. Örgü montajı, genellikle standart bir döngü stili montajı kullanarak 100 μm kristal monte etmekle aynı prosedürü izleyerek kristalleşme damlasından kristalleri balıklandırmak için kullanılır. Kristaller ağ boyunca dağıtılabilirken, önemli bir dezavantaj, hasat sırasında nispeten büyük bir sıvı hacminin ağ ve pim tarafından taşınabilmesidir (Şekil 1C,D). Kristallerin kendisinden kat kat daha büyük olabilen bu sıvı hacmi, X ışınlarıyla aydınlatıldığında arka plan gürültüsüne katkıda bulunacaktır. Bu arka plan dağılımı, sıvı flaş soğutması sırasında kristal buz oluşturursa daha da güçlü olabilir ve buz kırınım çözünürlükleri içinde zaten zayıf olan yoğunlukların sinyal-gürültü oranını azaltır. Bu nedenle, mümkün olan tüm sinyallerin kaydedilebilmesini sağlamak için fazla sıvının numuneden çıkarılması önemlidir. Bu zorluk, LCP’nin güçlü arka plan dağılımı oluşturduğu ve kristallerin çevresinden çıkarılmasının da zor olduğu lipid kübik fazı (LCP) içinde oluşan membran protein kristalleri durumunda daha da büyüktür 18.

Diamond Light Source’daki yeni Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi mikro odaklama (VMXm) kiriş çizgisi, potansiyel olarak bir mikrondan daha küçük boyutlardaki kristallerden veri toplama koşullarını sağlar. Kiriş çizgisi, 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, 60nm’den büyük olmayan bir karışıklık küresine ve vacuo örnek ortamında bir goniometre ölçen bir ışın profili sunmak için tasarlanmıştır. VMXm endstation’ın bu tasarım özellikleri, örnek14tarafından oluşturulan en büyük arka plan kaynağı ile veri toplama sırasında kiriş çizgisi aparatı tarafından arka plan X-ışını gürültüsünün oluşturulmasını en aza indirir.

VMXm kiriş hattı için tasarlanan özel numune hazırlama yöntemleri, bu arka planı azaltmak ve kırınım verilerinin sinyalden gürültüye daha da iyileştirilmesi için bir fırsat sunarak, 10 μm < ölçüm yapan mikrokristallerden kaydedilebilecek verilerin kalitesini en üst düzeye çıkarır. Mikrokristallerden düşük arka plan kırınımı için burada belirtilen gereksinimlerin çoğu kriyojenik iletim elektron mikroskopisi (kriyoTEM)19 ve mikrokristal elektron kırınımı (microED)20’dede yaygındır. Sonuç olarak, kriyoTEM örneklerinin hazırlanması için zaten geliştirilmiş olan aletlerin çoğu, bazı adaptasyonlarla, mikrokristallerin hazırlanması için uygundur. Tek parçacıklı kriyoTEM için numunelerin hazırlanmasında, inceltme altındaki parçacıklar, elektronların numuneden iletebileceği şekilde çok ince tabakalara (tipik olarak <100 nm) gömülüdür. İnce homojen tabaka, fazla sıvının blotting ile elde edilir ve numunenin vitrifikasyonu, numunenin (~104 K s-1) 21’inhızlı soğutulmasıyla ~ 93 K22’detutulan sıvı etan içine dalarak elde edilir. Buna karşılık, sıvı nitrojen, MX numune hazırlama için rutin olarak kullanıldığı gibi, etandan daha az verimli bir kriyojendir ve numune21içinde kristal buz oluşumu için daha fazla eğilime sahiptir. Kırınımı bozabilen ve arka plan gürültüsü oluşturabilen kristal buz oluşumu normalde kriyo koruyucu bileşiklerin kullanılmasıyla hafifletilir23. Poli etilen glikol (PEG) 400 ve metil-2,4-pentanediol (MPD) gibi düşük moleküler ağırlıklı polimerler, şekerler, yağlar veya doymuş tuzlar düşük konsantrasyonlarda kristalizasyon çözeltisinin bir aliquot eklenebilir24– en uygun kriyoprotektörü seçmek için ‘herkese uyan bir boyut’ çözümü yoktur ve bu genellikle optimizasyon gerektirir25 . Kristal ayrıca hasat sırasında birden fazla manipülasyona uğrar ve kristalin zarar görmesine neden olabilecek kriyo koruma işlemi, sıvı etan kullanma fırsatı bu adımın ihmaline izin verir ve kristalin bütünlüğünü korumaya yardımcı olur.

Sıvı etan, numunenin inceliği nedeniyle mikrokristaller için etkili bir kriyojen olsa da (<10 μm), kristalin buz oluşumunu önlemek için alternatif yöntemler vardır, özellikle daha büyük kristallerde, sıkı bir şekilde kontrol edilen nemli bir ortam kullanılarak kristalin su içeriğini azaltmak da dahil olmak üzere26veya fazla sıvının kristalin hem döngüsünden hem de yüzeyinden uzaklaştırılması yoluyla27 ancak, bunlar yine örneğin daha fazla değiştirilmesini gerektirir. KriyoTEM’de olduğu gibi sıvı etan ile otomatik şişirme ve dalma dondurma kullanımı, birlikte aşırı kristalizasyon çözeltisini ortadan kaldırır ve manipülasyonu en aza indirmeye çalışırken soğuk mikrokristalleri kontrollü bir şekilde yanıp sönmek için bir araç sağlar.

Burada, sadece VMXm kiriş çizgisi kullanıcıları ve diğer mikro odaklama kiriş hatlarında yüksek sinyalden gürültüye kırınım verilerini toplamak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz, aynı zamanda microED deneyleri için çözünür protein kristali ve deterjan bazlı membran protein kristali örnekleri hazırlayanlar için de yararlı olabilir. Numuneleri hazırlamak ve değerlendirmek için tüm tesisler VMXm’de mevcut olsa da, birçok yapısal biyoloji laboratuvarı kriyoTEM numune hazırlama için giderek daha fazla donatılmıştır. Sonuç olarak, bazı kullanıcıların VMXm’de örneklerini ışınlanma zamanına hazırlamak için kendi tesislerini kullanmak isteyebileceğini öngörüyoruz.

Protocol

1. Ekipman kurulumu NOT: Burada açıklanan yöntemler, tek bir şişkinlik koluna sahip bir dalma dondurma aleti kullanır. Bazı aletler iki şişkinlik kolu ile donatılmıştır ve kullanıcıya, cihazı yalnızca bir şişkinlik kolunun kullanımda olması için ayarlamak için üreticilerin talimatlarını kontrol etmesini tavsiye ederiz. Bir ışık mikroskopunun dalma dondurma aletinin yakınına yerleşmiş olduğundan emin olun, ideal olarak hem mikroskop hem de dalma dondurucu kullanıcının kolayca ulaşabileceği şekilde. Otomatik dalma dondurucuyu üreticilerin talimatlarına göre kurun ve soğutun.NOT: Numune odası sıcaklığı kristallerin yetiştirildiği sıcaklığa ayarlanmalıdır. Numune haznesine şişirme kağıdı yerleştirmeyin.DİkKAT: Sıvı etan oldukça yanıcı bir patlayıcıdır ve sadece potansiyel kıvılcım kaynaklarından uzak, iyi havalandırılmış bir alanda kullanılmalıdır. Izgara kutularını uygun şekilde etiketleyin ve sıvı nitrojen kullanarak küçük bir savaş alanında soğutin. Izgaraları, karbon film tarafını, kızdırma deşarjı için uygun bir taşıyıcıya (parafilme sarılmış cam mikroskop kaydırağı gibi) dikkatlice yerleştirin. 0,39 mBar’da 25 sn için ışıma deşarj kriyoTEM ızgaraları, 15 mA’lık bir akım kullanarak. Izgaralar kullanılmadan hemen önce ışıma deşarjı. Işıltı boşaltılmış ızgaraları kapalı bir Petri kabında hazır olana kadar saklayın; işıma deşarjı sonrası 30 dakika gelerse, ışıma deşarjını tekrarlayın.NOT: Dalma dondurucu hazır ve ızgaralar hazırlanmışken, dikkat numuneye dönebilir. 2. İlk blotting parametrelerini belirleme Numune odasının bağıl nem oranını ‘a ve şişkinlik süresini 5 s’ye ayarlayın ve şişirme tamamlandıktan sonra dalma dondurucusunun numuneyi otomatik olarak daldıracak şekilde ayarlandığından emin olun.NOT: Bu başlangıç parametreleri leica GP dalma dondurucu için en uygun olanıdır, şişirme kuvveti gibi diğer parametreler FEI Vitrobot’ta mevcuttur. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre kristal bütünlüğü tek bir şişkinlik kolu kullanılarak korunma olasılığı daha yüksektir. İlgi çekici kuyu açıldıktan sonra kristalizasyon tepsisini kapatabilmek için, küçük bir bant şeridi kesin ve mührü açmak için bir sekme oluşturmak ve bir tarafa dikkatlice yerleştirmek için bir ucun üzerine katlayın. Rezervuar da dahil olmak üzere kristalizasyon kuyusunun üzerindeki contayı kesin. Hızlı bir şekilde çalışarak, damladaki sıvı hacmini korumak için damla içeren kristale 2-5 μL rezervuar çözeltisi uygulayın. Teyp sekmesini kullanarak kuyuyu yeniden yapıştırın ve kristalleşme damlasının kurumadığını sağlayın. Bandı kristalizasyon kuyusunun üzerinde bir an için açık tutarken, rezervuar çözeltisinin 10 μL’lik kısmını daha sonraki adımlar için kullanmak üzere 0,5 mL’lik bir tüpe aktarın. Kuyuyu yeniden yapıştırın. Dalma dondurma aletinin şişkin koluna önceden kesilmiş bir parça şişkinlik kağıdı yerleştirin. Dalma donma önlüklerine tek bir ışıma deşarj ızgarası yerleştirin ve karbon tarafının şişkin koldan uzağa bakması için cihaza yükleyin. Şişkinlik odasındaki bağıl nemin% 90’da olduğundan emin olun. Karbon film tarafı şişkin kolla yüzleşecek şekilde kanatları döndürün. 2,5 μL pipet kullanarak, 0,5 mL’lik tüpten kriyoTEM ızgarasının desteksiz (parlak bakır) tarafına 2 μL rezervuar çözeltisi uygulayın. Izgarayı, karbon destek tarafı şişkinlik kolundan uzağa bakacak şekilde döndürün ve sıvıyı ızgaranın karbon filmi destek tarafına dikkatlice uygulayarak işlemi tekrarlayın. Karbon filme zarar vermemek için pipet ucuyla karbon filme dokunmaktan kaçının. Sıvı, kızdırma deşarjı sırasında biriken şarj nedeniyle ızgaraya yayılmalıdır. Izgarayı gözlemlerken blotting işlemini başlatın. Bu amaçla Leica GP2’de bir görüntüleme kapsamı mevcuttur. Sıvının bu süre zarfında ızgaranın karbon yüzeyinden çekilip çekilmediğini gözlemleyin, bu, sıvı ızgaradan kötü olduğu için ızgaradaki sıvı bolusların çoğunluğunun düzleştirmesiyle başlar. Her ızgara karesindeki sıvı daha da azaldığı için, ızgaranın yüzeyinde bir ‘patlama’ dalgası gözlemlenebilir. Bu etki gözlenirse, şişirme, haşhaş etkisinin sona elenmesinden sonraki 2-3 s içinde durdurulabilir. Atılabilen test ızgarasını daldırmak gerekli değildir. ‘Haşhaş’ etkisi gözlenmezse, 2.11-2.14 adımlarını tekrarlayın, her seferinde şişkinlik kolu ızgaradan çekilmeden hemen önce haşhaş etkisi gözlemlenene kadar lekelenme süresini 1-2 sn uzatın. 3. adım için bu kez not edin.NOT: İşlem sırasında kristallerin aşırı şişkinlikten susuz kalmamasını sağlamak için bu haşhaş etkisi meydana gelir gelmez şişkinliğin durması önemlidir. Kristallerin tutarlı bir çözeltiye tabi olmasını sağladığından, numunenin geri şişirilmesi ve seyreltilmesi için rezervuardan kristalizasyon çözeltisini kullanın, bu da kristallerin dengesini bozma riskini azaltır. 3. Kristallerin toplanması Kristalizasyon plakasını ışık mikroskobu altına yerleştirin ve hedefi görüş alanı içinde iyi konumlandırın. Dalma donduruculu önlüklere taze, parıltılı deşarjlı bir ızgara yerleştirin ve karbon film tarafı şişkin koldan uzağa bakacak şekilde kanatçıkları dalma dondurucusuna monte edin. Karbon film tarafı şişkin kolla yüzleşecek şekilde kanatları döndürün. 2,5 μL pipet kullanarak, 0,5 mL’lik tüpten kriyoTEM ızgarasının desteksiz tarafına 2 μL rezervuar çözeltisi uygulayın ve ızgarayı karbon filmi destek tarafının dalma dondurucusunun örnek bağlantı noktasına bakacak şekilde döndürün. Geçici contayı soyun ve pipet 2 μL’ye ayarlanmışken, mikrokristalleri askıya almak için kristalizasyon damlasını tekrar tekrar hafifçe epire edin (hava kabarcıklarını damlaya sokmamak önemlidir).NOT: Kristallerin herhangi bir yüzey derisinden veya kuyunun tabanından salınmasını sağlamak için bu işlemi ışık mikroskobu altında gözlemlemek önemlidir. Kristaller sıkışmışsa ve aspirasyonla çizilmemişse, pipet ucu veya akupunktur iğnesi gibi diğer kristalleşme araçları kristalleri hafifçe yerinden çıkarmak için kullanılabilir. Kristallerin büyüklüğüne ve ışık mikroskopunun alan derinliğine bağlı olarak, bazen mikroskobu kullanarak pipet ucuna giren kristalleri görüntülemek mümkündür. Emişli mikrokristal bulamacın 2 μL’lik kısmını dalma dondurucusa aktarın ve tüm numuneyi kriyoTEM ızgarasının karbon tarafına uygulayın. Adım 2’de belirlenen süre için lekelenin ve hemen dalma dondurmayı başlatın. Blotting yaparken, ızgara boyunca bir haşhaş dalgası efektinin oluşumunu gözlemleyin ve bunun tamamen ızgara boyunca oluşup oluşmadığını not edin. Kristallerin varlığı ilk şişkinlik süresini etkileyebilir ve bunun sonraki ızgaralar için 1-2 sn ayarlanması gerekebilir. Hızlı bir şekilde çalışarak, ızgarayı sıvı etandan sıvı nitrojene batırılmış ızgara kutusuna aktarın. Artık etan, sıvı nitrojene girdiğinde ızgaradaki opak beyaz bir katıya dönebilir. Bunu azaltmak için, ızgarayı sıvı etandan sürekli olarak çıkarın, ardından hızlı bir şekilde sıvı azot rezervuarı içine aktarın. Izgara kutusuna 4 ızgara yerleştirildikten sonra, kutunun kapağını vida ile sabitleyin ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile daha fazla numune değerlendirmesine izin vermek için sıvı nitrojenin köpük bir dewar’ına veya uygun bir depolama kabı kullanarak sıvı azot depolama dewar’ına aktarın. 4. Işık mikroskopisi ile örnek yoğunluk değerlendirmesi DİkKAT: Bu yöntem yıkıcıdır. Yalnızca bir veya iki kristalizasyon damlacıkları gibi sınırlı sayıda numune kullanılabilirliği varsa, bu adımın atlanması önerilir. Dalmadan sonra donma örnekleri (adım 3.7) kristallerin ızgara boyunca dağılımı değerlendirilebilir. Dalma-dondurucuya kuru, oda sıcaklığında bir kriyoTEM ızgarası takın ve kanatları görüş alanındaki ızgara ile birlikte ışık mikroskobuna yerleştirin. Tüm ızgaranın ve tek tek ızgara karelerinin çözümlenebilmesi için uygun bir büyütme ve odak ayarlayın. 3.1-3.7 adımlarını izleyin. Izgarayı ızgara kutusuna aktarmak yerine (adım 3.8), dalma derin dondurucuyu sıfırlayarak dalmış ızgarayı sıvı etandan geri çek.DİkKAT: Izgara ve numune oda sıcaklığına ısınacak ve daha fazla kırınım deneyi için kullanılamaz. Kanatları dalma dondurma aletinden çıkarın. Izgarayı kümesler içinde tutarken, ızgarayı ışık mikroskobu altına yerleştirin – odak zaten kabaca ayarlanmış olacaktır. İnce bir odak gerçekleştirin ve kristallerin ızgaradaki yoğunluğunu değerlendirin. İyi bir ızgara, her ızgara karesi içindeki ızgara çubuklarından uzakta birkaç izole kristal içerecektir ve kristallerin topaklanıyor olması minimumdur. Izgara içindeki kristallerin yoğunluğunun kristallerin sadece birkaç izole kristalle topaklanmasıyla sonuçlandığı durumlarda, kristal bulamacı rezervuar çözeltisi ile daha da seyreltin ve 3. Numuneleri seyreltirken dikkatli olun, böylece seyreltme kristallerin çözünmesine neden olmaz. 0,5-1 μL’lik küçük hacimler kullanarak kristalleri adım adım seyreltin. 5. Elektron mikroskopisi taranarak numune değerlendirmesi NOT: KriyoTEM ızgaralarında mikrokristal preparat en iyi kriyojenik koşullar altında taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile değerlendirilir, bu kriyo-aşama ile donatılmış bir SEM ile elde edilebilir. VMXm’de, Pp3006 çekirdek hava kilidi ve kriyostajlı bir JEOL JSM-IT100 SEM (tungsten kaynağı) kullanılmaktadır. VMXm28,29’dakiörnekleri görüntülerken minimum radyasyon hasarı sağlamak için aşağıdaki ayarlar kullanılır: 5 kV hızlanan voltaj; 40 spot boyutu (JEOL JSM-IT100’deki rastgele birimler); 10 mm çalışma mesafesi. Görüntüler ikincil elektron dedektörü kullanılarak kaydedilir, numune hizalaması için ve odaklama süresi 0,8 μs kullanılırken, tek kristallerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri 16 μs’lik bir bekleme süresi kullanılarak yakalanır. SEM’e bir örnek yüklemeden önce mikroskobun üretici talimatlarına göre hizalanmış olması önemlidir. Aynı parametrelerle hazırlanan kalan ızgaralar X-ışını kırınım deneyleri için ayrılırken SEM’e yalnızca tek bir ızgaranın yüklenmesi önerilir. Numune kriyo aşamasını üreticinin talimatına göre -180 °C’ye soğutarak SEM’i hazırlayın. CryoTEM ızgaralarını mevcut belirli bir sisteme yükleme yönergelerini izleyin. Numune SEM’e yüklendiğinde, elektron ışınını açın, numuneyi hizalayın ve yüksek büyütme (0,8 μs durma süresi) kullanarak odağı ayarlayın. İlk olarak, ilk değerlendirmeyi düşük büyütmede (x45) görüntülenen ızgaranın tamamıyla gerçekleştirin. Bu büyütmede bir görüntü kaydedin. Tek tek ızgara karelerinin daha yakından incelenmesine izin vermek için büyütmeyi artırın, bireysel kristaller çok net bir şekilde gözlemlenebilir olmalıdır. Devam etmeden önce aşağıdaki gereksinimleri karşıladıklarından emin olmak için kristallerin durağan görüntülerini (16 μs durma süresi) yakalayarak ızgaranın etrafında hareket edin: Izgaraların düz olduğundan ve karbon destek filminin büyük ölçüde sağlam olduğundan emin olun. Kristali çevreleyen vitrifiye sıvının dar bir halesine sahip çok sayıda tek kristal olduğundan emin olun. Karbon destek filmindeki deliklerin görünür olduğundan emin olun. Koyu ve pürüzsüz bir görünümle tanımlandığı gibi büyük vitrifiye sıvı bölgeleri olmadığından emin olun. Çok az altıgen buz veya yüzey buzlarının ızgaraya saçıldığından emin olun. Kristallerin destek filmi boyunca eşit olarak dağıtıldığından ve üst üste binmediğine emin olun. Bu noktada, daha sonraki kırınım deneyleri sırasında doğru bir X-ışını ışını boyutu korelasyonu sağlamak için bir dizi kristalin boyutlarını doğru bir şekilde ölçün. SEM’den güvenilir bir şekilde alınabilen ve kriyojenik sıcaklıklarda muhafaza edilebilen numuneler daha sonra X-ışını kırınım deneyleri için kullanılabilir. Bu mümkün değilse, bu örnekleri atın.NOT: Hem tüm ızgarayı hem de bireysel mikrokristalleri (sırasıyla yaklaşık x45 ve x700 büyütme) görüntüleme yapılırken, aynı parametreler kullanılarak hazırlanan ızgaralarla kiriş çizgisine geçilip geçilmeyebileceği veya bazı parametrelerin adım 3 sırasında ayarlanması gerekip gerekmediği konusunda bir değerlendirme yapılmalıdır. Izgaralar, 5.5 adımında açıklanan testleri karşılamalıdır. Izgaralar bu ölçütleri karşılamazsa, 5. 6. VMXm’de kırınım deneyleri için ızgara hazırlama Numune kartuşuna (kapaklı) yüklenen gerekli sayıda VMXm numune tutucuyu(Şekil 4A)(kapaklı) sıvı nitrojen kullanarak büyük bir köpük dewar(Şekil 4B)içinde numune yükleyici ile soğutun – bu büyük miktarda sıvı azot gerektirebilir. Sıvı nitrojen seviyesi, numune yükleyicisinin numune konumunun hemen üzerinde olmalıdır. Daire ve aletler hazırlayın. Kırpma aleti, tokmaklar ve VMXm örnek tokmaklar gibi aletleri soğutmak için numune yükleyicisinde deliklere yerleştirin. Dewar’ın üzerinde bir spot ışığı düzenlemek yararlı olabilir. Mikrokristal yüklü ızgaraları içeren ızgara kutusunu numune yükleyicisinin ızgara kutusu girintisine hızlı bir şekilde aktarın ve kapağı gevşek ve döndürülebilir olacak şekilde sökün (çıkarmayın). Sıvı nitrojen altında kapağı büyük tonpslu numune kartuşundan çıkarın ve numune yükleyicisinin altına yerleştirin. Numune tutucuyu numune yükleyicisinin üzerine kaldırmak için VMXm örnek tokmaklarını kullanın, böylece tutucunun bir ızgarayı kabul edebilmesi için yukarı doğru dönük olduğundan emin olur. Doğru konumdayken, numune yükleyici üzerindeki küçük bir pim, numune tutucunun ortasındaki küçük deliğe girer. Soğutulmuş ince tokmaklarla ızgarayı ızgara kutusundan dikkatlice kaldırın ve numune tutucusunda ızgara açıklığının yakınını aktarın. Izgarayı düz olacak şekilde döndürün (destek filmi tarafının hangi yöne bakan olduğu önemli değildir). Kılavuz ızgara açıklığı üzerinde mümkün olduğunca yakın olacak şekilde asaları hafifçe küstür (ızgarayı bükmemeye dikkat edin) ve ızgarayı açıklığa bırakın. Izgara düzgün oturmazsa, ızgarayı yerine itmek için ince tokmakları dikkatlice kullanın veya numune tutucuya daha büyük toparlaplarla hafifçe dokunun. Önceden soğutulmuş circlip aracını ızgara açıklığında ızgaranın üzerine hızlıca yerleştirin ve düğmeye basarak daireyi oturtun. Dairenin düzgün oturduğundan emin olmak için düğmenin 2 çökerek uygulanması yararlı olabilir. Sıvı nitrojeni, seviye numune tutucusuna ~1,5 cm olacak şekilde toplayın. VMXm örnek tokalarını kullanarak, yüklenen numune tutucuyu numune yükleyicisinin üzerindeki küçük pimin üzerine ve numune kartuşuna geri dikkatlice kaldırın. Örnek kartuştaki numune tutucusunun konum numarasına dikkat edin. Tüm numuneler yüklenene kadar izgaraları numune tutuculara yüklemeye devam edin. Örnekler içeride kalırsa ızgara kutularını depolama alanına döndürün ve daha fazla alan oluşturmak için örnek yükleyiciyi dewar’dan çıkarın. Kartuşun üst kısmındaki pimin kapaktaki deliğe girmesini sağlayarak kartuşun kapağını değiştirin. VMXm hava kilidi dewar’ını sıvı nitrojenle soğutun ve doldurun ve yüklü numune kartuşunu içeren köpük dewar’ın yanına yerleştirin. VMXm kartuş aracını kullanarak, aleti kartuşun yan tarafındaki sırtlara dikkatlice yer edin ve kartuşu hızla hava kilidi dewar’ına kaldırın. Sıvı nitrojen seviyesinin kartuşu kapladığından emin olun. Hava kilidi dewar üzerine kapak yerleştirin ve yüklü numune kartuşu ile VMXm uç istasyonuna ilerleyin.NOT: Numune kartuşunun VMXm uç istasyonuna yüklenmesi beamline personeli tarafından gerçekleştirilecektir.

Representative Results

Bu protokolün amacı, kırınım sinyalini iyileştirmek için minimum arka plan saçılımı ile X-ışını kırınım deneyleri sağlayan kristali çevreleyen minimum hacimli sıvı ile vitrifiye mikrokristaller elde etmektir. Minimal arka plan saçılım için kriyoTEM ızgaralarında hazırlanan mikrokristallerin örnek SEM görüntüleri Şekil 1A,B ve Şekil 2’degösterilmiştir. Eşit dağıtılmış tek kristallere sahip ızgaralar, iyi sinyalden gürültüye kadar ızgaranın en verimli şekilde kullanılmasını sağlayacaktır. Ancak, bu genellikle ızgaranın tamamında mümkün değildir ve bazı bölgeler bir miktar topaklanabilir (Şekil 2A,B). Bu topaklenmeye rağmen, bu örnekler hala düşük arka plan kırınımı sağlayacak yararlı sayıda tek izole kristal görüntüler (Şekil 5). Hala düşük arka plan dağılımını koruyan blotting düzeyi değişebilir. Karbon destek filmindeki deliklerin açıkça görülebilecek şekilde güçlü şişkinlik ancak kristallerin hidratlı kalması amaçtır (Şekil 2C,D). Bununla birlikte, iyi kalitede ızgaralar hala destek filminin deliklerinde bir miktar sıvı görüntüleyebilir, ancak deliklerin konumu hala tanımlanabilir olmalıdır (Şekil 2A,B). Daha da önemlisi, tüm bu örnekler, şişkinlik ve dalma donması arasındaki hidrasyonu korumak için kristali çevreleyen vitrifiye bir sıvı halesi ile tek, izole kristaller görüntüler. Birçok örnek, şişkinlik süresinin veya mikrokristallerin konsantrasyonunun değişimini içerebilen daha fazla optimizasyon gerektirebilir (Şekil 3). Kristallerle aşırı yüklenmiş ızgaralar daha az lekelenme verimliliği gösterecektir ve tek kırınım görüntülerinde birden fazla kafes kaydedilmesine neden olabilir (Şekil 3A,B). %8 PEG 4000 ve etilen glikol(Şekil 3C)içeren tripsin gibi daha viskoz kristalizasyon koşulları, daha uzun şişkinlik sürelerine (>10 sn) ihtiyaç duyabilir. Tersine, çok hızlı bir şekilde lekelenme olan çok düşük viskoziteye sahip kristalizasyon koşulları, lekelenme gerçekleşmeden önce yerleşmeye neden olan yerçekimi nedeniyle dağıtım sorunlarından muzdarip olabilir ve bu da tüm mikrokristallerin ızgaranın bir tarafı boyunca yerleşmesine neden olabilir(Şekil 3D). Numunelerin optimum hazırlanması, yüksek sinyalden gürültüye sahip mümkün olan en yüksek çözünürlükte yüksek kaliteli X-ışını kırınım verilerini toplamak için VMXm’in tüm yeteneklerinden yararlanılmasını sağlar (Şekil 5). Bu örnekler, in-vacuo örnek ortamıyla uyumlu olmaktan yararlanır ve kırınım görüntülerinde çok düşük veya sıfır ortalama arka plan sayısına neden olur. Sıvı etan kullanımı, kriyo koruyucu olmadan, buz halkalarının yokluğuna neden olur (Şekil 5), kristallerin bakır ızgara çubuklarına yakın uzandığı durumlarda, X-ışını ışını çubuklara bakabilir ve bu da ~2.1 şve ~ 1.8 Å’da bakır toz kırınım halkaları ile sonuçlanır. Şekil 1: Mikromesh montajları ve cyoTEM ızgaralarında mikrokristal montaj karşılaştırması. 2,5 μm çapında(A, B) 5 kV hızlanan voltaj, 39 (rastgele birim) spot boyutu ve 16 μs’lik bir durma süresi olan virüs polihedralinin dalmış donmuş mikrokristallerinin elektron mikrografilerinin taranması. Izgara fazla sıvıdan arındırılmıştır (A), kristalleri (B) çevreleyen dar bir sıvı halesi görülür. Sıvı nitrojende flaş soğutmadan önce bir mikromesh ‘e (20 μm diyafram) monte edilen ve I24 face-on (C) ve yan(D)beamline’daki eksen görüntüleme sistemi kullanılarak gözlemlenen aynı numuneler. Optik bozulmalar (C) yüz yüze görüntülerken mikromesh boyunca sıvı kalınlığının boyutunun bir göstergesini verir, bu mikromesh yan yana (D) görüntülerken daha nettir. C ve D’deki kırmızı hedef X-ışını ışın konumunu ve boyutunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Kaliteli numune örnekleri. Tek bir ~100 μm ızgara kare boyunca gözlemlenen polihedra kristalleri (A). Kristallerin bazıları hafifçe topaklanmış ve çevredeki sıvının bir miktar bağlantısını gösterirken, kristali çevreleyen küçük bir sıvı halesi ile izole edilmiş tek kristaller vardır. ~5 x 5 μm ölçülerindeki biraz daha büyük insülin kristalleri (B) de bazı topaklamalar gösterir, ancak yine iyi izole edilmiş bireysel kristaller vardır. İğne kristalleri çok dar bir boyuta sahip olabilir ve bu iğne şeklindeki lysozyme kristalleri (C) gibi bir mikrobura gerektirebilir. Bu kristalleri çevreleyen dar bir sıvı bandı görülebilir (açık gri hale). Onlarca mikrona kadar daha büyük mikrokristaller de bu ~7 μm proteinaz K kristalleri (D) gibi kriyoTEM ızgaralarına iyi monte edilebilir. Hem (C) ve (D) hem de daha az ölçüde (A) içinde karbon destek filminin delikleri açıkça görülebilir ve çok az / hiç sıvının varlığını gösterir. Örneğin B’de, boş delikler gözlenmmekle birlikte, deliklerin konumu hala tanımlanabilir, bu da sıvının sadece destek filmindeki delikleri doldurduğunu gösterir. Tüm bu örneklerde, deliklerin daha açık gri bir görünüme sahip olduğu ızgara karesinin (yuvarlatılmış bir iç kare) kenarında bir sıvı halesi görülebilir. Bu, iyi hazırlanmış ızgaraların ortak bir özelliğidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Daha fazla optimizasyon gerektiren numune örnekleri. Mikrokristallerle aşırı yüklenmiş ızgaralar (A, B) numuneler destek filmindeki delikleri bloke ederek şişkinlik verimliliğini azalttığı ve kristaller arasında daha yüksek bir yüzey gerilimi ile daha fazla sıvı kaldığı için arka plan dağılımını artırabilir. Sinyalden gürültüye bir bozulmanın yanı sıra bilgi kaybına neden olan bir bozulmanın yanı sıra, birden fazla kafesin kaydedilmesi muhtemeldir. Yeterince uzun olmayan bir şişkinlik süresi veya yüksek viskoziteli bir kristalizasyon çözeltisi kullanmak, aşırı ıslak bir numuneye (C)neden olabilir ve ayrıca düşük sinyalden gürültüye neden olabilir. Sığır insülini (D) gibi çökeltisiz kristalizasyon koşulları çok düşük viskoziteye sahiptir. Bu çok kısa bir şişkinlik süresi ile sonuçlanırken, yerçekiminin etkisiyle kristallerin şişkinlik öncesi ve sırasında ızgara boyunca hareket etmesine de neden olabilir. Bu genellikle bir kenar boyunca yüksek kristal konsantrasyonuna sahip büyük ölçüde boş bir ızgara ile sonuçlanır (D). Kristal akışını azaltmak ve kristallerin dağılımını iyileştirmek için ızgaraya uygulamadan kısa bir süre önce kristal bulamacına etilen glikol gibi viskoz bir ajan eklemek avantajlı olabilir. Bu aynı zamanda şişkinlik süresini uzatarak şişkinliği gözlemlemeyi kolaylaştırabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: VMXm’de örnek yükleme araçları. VMXm örnek tutucularını (A) yüklemek için ısmarlama bir takım araçlar tasarlanmıştır. Örnek yükleyici (B) çalışırken tek bir VMXm örnek tutucu, ızgara kutusu ve takım depolama alanına sahiptir. Ayrıca sıvı nitrojenin yüzeyinin hemen altında çalışmaya izin vermek ve numune kartuşunun (B)altına sığmasını sağlamak için tasarlanmıştır. VMXm uç istasyonundaki hava kilidi azot gazı kutusuna uyan airlock dewar(C),yüklenen numune kartuşunu laboratuvardan beamline deneysel hutch’a götürmek için kullanılır. Çevrimdışı SEM’deki örnekleri görüntülemek için, kiriş hattında kullanılan numune tutucuda değerlendirmeyi etkinleştirmek için temelsiz VMXm örnek tutucudan oluşan ısmarlama bir mekik(D)yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: VMXm’de mikrokristallerden örnek kırınım. Dalma dondurma yöntemi kullanılarak kriyoTEM ızgarasına monte edilmiş ~3 μm virüs polihedral kristalinin VMXm’deki Pilatus 3 6M dedektörü kullanılarak kaydedilen tek bir kırınım görüntüsü. Kırınım 1,7 Å’nın ötesine doğru gözlenir ve 1,74 Å’daki bir yansıma (mavi kare) içe geçmiştir ve sıfır sayıya sahip yüksek sayıda pikselle düşük arka plan dağılımını gösterir. Kristal bulamacı ızgaraya uygulamadan önce kristal bulamacına v/v’lik son konsantrasyona etilen glikol eklenmiştir. VMXm örnek konumunun düşük arka plan yapısı, ışın merkezinin yakınında bile mavi kesik çizginin altında çizilen yoğunluklarda gösterildiği gibi görüntü boyunca sabit arka plan ile gösterilir. Çizilen yoğunluklar arka planın 3 sayının altında kaldığını gösterir. 2.15 şve 1.86 Å’da kriyoTEM ızgarasının bakırının toz kırınımı ile oluşturulan iki soluk halka gözlenir. Tespit edilebilir buz halkaları yoktur, bu da şişkinliğin etkinliğini ve ardından sıvı etan ile soğutmayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, kriyoTEM numune hazırlama araçlarının mikro odaklama kiriş hatlarında X-ışını kırınım deneyleri için mikrokristallerin hazırlanmasında nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Standart kiriş hattı enstrümantasyonu pime monte edilmiş bir numune etrafında ortalanır ve mikrokristaller için bu montajlarda örnek desteği sağlamak için çaba sarfedilirken, en yüksek sinyalden gürültüye ulaşılmasını sağlarken genellikle numune ile yüklenmesi zordur(Şekil 1C,D). Bu örneklerin çoğu, numunenin vitreus olduğundan emin olmak için kriyo koruma koşullarının optimize edilmesi gerektirebilir. Dalma dondurma yöntemi, fazla sıvıyı çıkarmak ve numuneyi etkili bir kriyojende soğutmak için tekrarlanabilir bir yol sağlar (Şekil 1A,B). Izgara daha sonra cımbız tabanlı bir pim montajı ile standart bir kiriş çizgisine monte edilebilirken, VMXm numune tutucuları ızgaraları kabul etmek ve iletken soğutma yoluyla vakum ortamında cam geçiş sıcaklığının altında tutmak için özel olarak tasarlanmıştır. VMXm’in örnek ortamı, örneğin kalan arka plan kaynağı olduğu düşük arka plan veri toplamayı sağlar ve kristalleri 10 μm’den küçük boyutlara eşleştirmek için kullanılabilecek bir mikrobüm sağlar. Bu örnek hazırlama yöntemi, elektronların zayıf penetrasyonu nedeniyle çok az fazla sıvı ve vitreus numunesi gereksinimi olan elektron kırınımı için nanokristaller hazırlamak için de kullanılabilir. KriyoTEM ızgaraları kırılgan olsa da, kristallerin döngüler halinde toplanmasında deneyimli olanlar, ızgaraların kullanımına hızlı bir şekilde adapte olacaktır. Az miktarda deneyimle, protokolün şişirme, dondurma ve yükleme aşamalarında birkaç ızgara kaybolacaktır. Bununla birlikte, optimizasyon adımları bu başarı için kritik öneme sahiptir ve dikkatli hazırlık kristalleri kaybetme veya kristal bütünlüğünü azaltma şansını azaltacaktır.

CryoTEM ızgaraları, yüzlerce kristal içerebilen nispeten büyük bir tek montaj sağlar, böylece yalnızca küçük bir kırınım verisi kaması kaydetmenin mümkün olabileceği aktarım hızını artırır. Tek bir ızgara, özellikle yüksek simetri kristallerinde protein yapısını belirlemek için yeterli kristal sağlayabilir. Sadece bir veya iki tek kristalizasyon damlasının mikrokristal oluşturduğu durumlarda, kristalizasyon durumunun tek başına deneme lekelenmesi, mikrokristaller şiştiğinde, kullanılan sürelerin ilk iyi kalite örneklerini üretmek için gerekenlere mümkün olduğunca yakın olmasını sağlamaya yardımcı olabilir. Karbon film destekleri X ışınları tarafından görülemez ve belirli bir morfolojiye uyacak şekilde kullanılabilen farklı delik aralıklarıyla mevcuttur. En yaygın olarak 2 μm aralıkta 2 μm delikli destek filmleri kullanırız, ancak daha fazla aralıklı daha küçük delikler 2 μm’den küçük kristaller için daha uygun olabilir. 4 μm aralıklı 1 μm delikli olanlar gibi diğer destek filmlerinin yanı sıra farklı şekilli deliklere sahip destek filmleri de mevcuttur ve bunların hepsi şişkinlik süresini etkileyecektir. 200 (inç başına 200 kare) ızgara kare örgü boyutu da bakır ızgara çubukları arasında yeterli alan (~100 μm) sağlar, böylece X-ışını ışını kristallerle yüklü karbon filmi için yeterli yapısal destek sağlarken bakırla güçlü bir şekilde etkileşime girmez. Sıvı etan kullanımı kriyoprotektan ihtiyacını azaltır, bu da kriyoprotektan koşullarının optimizasyonunda kullanılacak numune hacmi gereksinimini azaltır.

İşlem sırasında optimize edilecek ana parametreler, blotting süreleri ve numune seyreltmedir. Blotting süreleri, donmadan önce ızgaranın tamamında ‘haşhaş’ etkisini gözlemleyecek kadar uzun olmalıdır. Aşırı şişkinlik kristallerin susuz kalmasına neden olabilir, ancak bu etkiyi en aza indirmek için numune odasındaki nemin kontrolü kullanılır. % 90’lık bağıl nemin kullanıldığı öne sürülse de, bazı numuneler nemin optimizasyonunda fayda sağlayabilir. Nem, yavaşça suya doygun hale gelebilecek şişkinlik kağıdının şişkinlik verimliliğini etkileyebilir. Ek olarak, numune odasındaki nem kontrolü kristallerin kırınım kalitesini artırmak için kullanılabilir30. Kırınım kalitesinin bozulmamasını sağlamak için kırınım bütünlüğünü kontrol etmeden önce nemde küçük değişiklikler (%<5) yapılması önerilir.

Değerli olmayan numunelerin optimizasyonu SEM yerine hafif bir mikroskop kullanılarak yapılabilir. Yıkıcı olmasına rağmen, kristallerin ızgaradaki yoğunluğunu değerlendirmek ve kristalleri ızgara boyunca daha iyi dağıtmak için bir numunenin seyreltilmesi veya konsantre edilmesi gerekip gerekmediğine karar vermek için yararlıdır. Bu adım en çok sayıda kristal ve özellikle yüksek konsantre numuneler olduğunda kullanışlıdır. Kristallerin bir araya toplanmasını önlemek gerekir (Şekil 3), veri toplama sırasında iki kristalin aynı anda aydınlatılması önemli bir sorun olmasa da6, muhtemelen kümeyi çevreleyen daha büyük bir sıvı hacmi olacaktır, böylece sinyalden gürültüye (Şekil 5) azaltılır. Bir ışık mikroskobu kullanarak küresel olarak büyük sıvı fazlalıklarını gözlemlemek mümkün olsa da, mikrokristalleri çevreleyen sıvı hacminin ve kristal buzun varlığının değerlendirilmesi ancak kriyojenik vakum transfer sistemi ve aşaması ile donatılmış bir elektron mikroskobu kullanılarak yapılabilir. Bazen, kristallerin ızgaraya uygulanmasından sonra ve lekelenme gerçekleşmeden önce, düşük viskoziteli çözeltilerdeki kristaller ızgaranın bir kenarı boyunca yerleşebilir. Etilen glikol%50’ye kadar son konsantrasyonun eklenmesinin kristallerin damlacık boyunca hareketini yavaşlatabileceğini, mikrokristallerin ızgara boyunca daha iyi dağılımını sağlayabileceğini ve şişkinlik süresini artırarak şişkinlik üzerinde daha fazla kontrol sağlayabileceğini bulduk(Şekil 3D).

Yüksek moleküler ağırlıklı PEG’ler gibi viskoz çökelten ajanlar içeren bazı kristalizasyon çözümleri, giderek daha uzun şişkinlik süreleri (>10 s) gerektiren şişkinliğe zor gelebilir. Bu gibi durumlarda, ızgaranın arkasında biriken sıvı hacmini ve ızgaranın destek filmi tarafına çözelti içeren kristalin hacmini azaltmak yararlı olabilir. 2 kat şişirme kağıdı veya cam elyafı kullanmak gibi stratejiler de bu zor durumlarda şişkinliğe yardımcı olabilir31.

Bu boru hattı çözünür protein kristalleri için uygun olsa da, LCP’deki membran proteinleri gibi çok viskoz ortamlarda oluşanlar, bu protokolün uygun olmadığı farklı bir zorluk sunar. Bununla birlikte, kriyoTEM ızgaralarında LCP kristallerinin mikroED için hazırlanması için stratejiler ortaya çıkıyor ve bu stratejiler, LCP’ye faz değişikliği sağlayarak numunelerin viskozitesini azaltmayı içeriyor. Bu, örneklerin bu makalede açıklanana benzer şekilde ızgaralara uygulanmasına izin sağlar. Son olarak, numune, fazla kristal olmayan malzemeyi çıkarmak için odaklanmış bir iyon ışını ile öğütilebilir32,33,34.

Genel olarak, bu işlem hattının VMXm’ye gelen numuneden numune kullanılabilirliğine, kristallerin konsantrasyonuna ve kristalizasyon çözeltisinin viskozitesine bağlı olarak iyi dağılmış, vitrifiye edilmiş numunelerle optimize edilmiş ızgaralar sağlamaya kadar takip etmesi genellikle 1-2 saat (ekipman kurulum süresi dahil) sürecektir. Bu yöntemler, numuneyi çevreleyen minimum miktarda sıvının gerekli olduğu mikrokristallerde radyasyon hasarını araştıran X-ışını kırınım deneyleri için mikrokristallerin hazırlanması için zaten başarıyla28,35. Protokolün sadece optimize edilmiş numuneleri iyi dağıtmak için değil, çözünür tüm mikrokristal örneklere uygulanabileceği belirtilmelidir. Mikrokristalin malzeme üreten bir kristalizasyon deneyi geleneksel olarak daha büyük kristaller elde etmek amacıyla optimizasyon için bir hedef olacaktır, ancak bu örnek hazırlama yöntemi ve VMXm’nin yetenekleri, daha fazla optimizasyon olmadan bu tür örneklerden yeterli verilerin toplanmasına izin verebilir. Alternatif olarak, bu tür mikrokristalin örnekleri kötü bir şekilde yayılırsa, bu örnek hazırlama yöntemi kullanılarak VMXm’den toplanan veriler, kristalizasyon koşullarının daha da optimizasyonu için yararlı bir kılavuz görevi görebilebilir. Işıma boşaltma ve dalma dondurma da dahil olmak üzere ızgaraları hazırlama araçları artık kriyoTEM deneyleri için donatılmış araştırma enstitülerinde yaygın olarak mevcuttur ve VMXm’de ışınlama süresinden önce numune hazırlamalarını sağlayan birçok kullanıcı tarafından kullanılabilir olacaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton ve Dave Stuart’ a, Oxford STRUBI Üniversitesi’ ne ve Southampton Üniversitesi’nden Rachel Bolton’a, kiriş hattının devreye alınmasına olanak sağlamanın yanı sıra VMXm kiriş hattı için numune hazırlama yöntemlerinin geliştirilmesi ve gösterilmesi için mikrokristal örnekler sağladıkları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca bu makalenin yayımlanmasındaki fırsat ve destek için iNEXT-Discovery’ye (proje numarası 871037) teşekkür eder.

Materials

Automated Cryo-EM plunge freezing instrument Leica or ThermoFisher Various
Benchtop light microscope with light source Various Various
Blade/Scalpel Fisher Scientific Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes Quantifoil N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes Agar Scientific AGG3727
ddH2O n/a n/a
Ethane gas supply n/a n/a
Ethylene Glycol Acros Organics 146750010
Glass microscope slides FisherBrand 12383118
Glass petri dish FisherBrand 455732
Glow discharging device Pelco 91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm) Bemis HS234526B
Large and small, fine forceps Agar Scientific Various
Liquid nitrogen supply n/a n/a
Pipette tips Various Various
Pipetting devices Various Various
Sealing tape for crystallisation plates. Molecular Dimensions MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars Spearlab Various
Sprung circlip clipping tool Subangstrom SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper Leica 16706440
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496 (2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).
  15. . MiTeGen Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020)
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

Tags

AI-assisted Sample PreparationMicrocrystal HandlingCryoTEM Grid PreparationPlunge FreezingBackground ReductionX-ray DiffractionSample BlottingCrystallization Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Crawshaw, A. D., Beale, E. V., Warren, A. J., Stallwood, A., Duller, G., Trincao, J., Evans, G. A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline. J. Vis. Exp. (172), e62306, doi:10.3791/62306 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image