Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.
Les lipides neutres (LNI) sont une classe de biomolécules hydrophobes et sans charge qui jouent un rôle clé dans l’homéostasie énergétique et lipidique. Les NL sont synthétisés de novo à partir de l’acétyl-CoA et sont principalement présents chez les eucaryotes sous forme de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE). Les enzymes responsables de la synthèse des LNL sont hautement conservées de Saccharomyces cerevisiae (levure) à l’homme, faisant de la levure un organisme modèle utile pour disséquer la fonction et la régulation des enzymes du métabolisme NL. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la façon dont l’acétyl-CoA est converti en un ensemble diversifié d’espèces NL, des mécanismes de régulation des enzymes du métabolisme NL et comment une mauvaise régulation peut contribuer aux pathologies cellulaires sont encore en cours de découverte. De nombreuses méthodes d’isolement et de caractérisation des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador ont été mises au point et utilisées au cours de décennies de recherche; toutefois, il n’a pas été question d’un protocole quantitatif et simple pour la caractérisation complète des principales espèces de Terre-Neuve-et-Labrador. Ici, une méthode simple et adaptable pour quantifier la synthèse de novo des principales espèces nl dans la levure est présentée. Nous appliquons 14marques métaboliques de l’acide C-acétique couplées à la chromatographie sur couche mince pour séparer et quantifier une gamme variée de NL physiologiquement importantes. De plus, cette méthode peut être facilement appliquée pour étudier les taux de réaction in vivo des enzymes NL ou la dégradation des espèces NL au fil du temps.
L’acétyl-CoA est l’élément constitutif fondamental de diverses biomolécules, y compris les lipides neutres (LNL), qui servent de monnaie biomoléculaire polyvalente pour la construction de membranes, la génération d’ATP et la régulation de la signalisation cellulaire1,2. La disponibilité des LNL à être déviés dans l’une de ces voies respectives est, en partie, réglementée par leur stockage. Les gouttelettes lipidiques (LD), organites cytoplasmiques composés de noyaux hydrophobes de triglycérides (TG) et d’esters de stérols (SE), sont les principaux compartiments de stockage de la plupart des LL cellulaires. En tant que tels, les LD séquestrent et régulent les LNL, qui peuvent être dégradés et ensuite utilisés pour les processus biochimiques et métaboliques3,4. On sait que la mauvaise régulation des protéines associées à la NL et à la LD est corrélée à l’apparition de pathologies telles que la lipodystrophie et les syndromes métaboliques5,6. Pour cette raison, la recherche actuelle sur la LD est intensément axée sur la façon dont la synthèse NL est régulée spatialement, temporellement et à travers des tissus distincts d’organismes multicellulaires. En raison des rôles cellulaires omniprésents des NL, de nombreuses enzymes responsables de la synthèse et de la régulation des LNL sont conservées dans l’ensemble des eucaryotes7. En effet, même certains procaryotes stockent les LL dans les LD8. Par conséquent, des organismes modèles génétiquement traitables tels que Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante) ont été utiles pour l’étude de la synthèse et de la régulation des NL.
La séparation et la quantification des LN à partir d’extraits cellulaires peuvent être réalisées de multiples façons, y compris la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la chromatographie liquide ultra-performance-spectrométrie de masse (UPLC-MS)9,10,11. Peut-être que la méthode la plus simple pour séparer les LNL est par chromatographie sur couche mince (TLC), qui permet une quantification densitométrique ultérieure à partir d’une courbe standard12,13. Bien que le TLC ne fournisse qu’une séparation des LNL, il reste une technique puissante car il est peu coûteux et permet la séparation rapide des LNL de plusieurs échantillons simultanément. Deux des défis les plus considérables auxquels est confrontée l’étude des LNL via TLC sont: 1) le large éventail d’abondances cellulaires des espèces NL et de leurs intermédiaires, et 2) la gamme d’hydrophilie / hydrophobicité des intermédiaires lipidiques dans les voies de synthèse NL. Par conséquent, la quantification des espèces de Terre-Neuve-et-Labrador par LTC est généralement limitée aux espèces les plus abondantes; cependant, l’introduction d’un radiomarque de l’acide C-acétique 14peut améliorer considérablement la détection des intermédiaires de faible abondance dans les voies NL. L’acide acétique est rapidement converti en acétyl-CoA par l’acétyl-CoA synthétase ACS214, ce qui fait de l’acide 14C-acétique un substrat de radiomarquage approprié dans la levure15. De plus, la séparation des LNL hydrophobes et des intermédiaires hydrophiles des LNL peut être réalisée par TLC grâce à l’utilisation de plusieurs systèmes de solvants16. Ici, une méthode est présentée pour la séparation des LNL en utilisant le label métabolique de l’acide C-acétique 14dans la levure. Les lipides marqués pendant la période de pouls sont ensuite isolés par un protocole d’isolement lipidique total bien établi17,suivi de la séparation des espèces NL par TLC. Le développement de plaques TLC par autoradiographie pour visualiser les lipides marqués et par pulvérisation chimique pour visualiser les lipides totaux permet de multiples méthodes de quantification. Les bandes lipidiques individuelles peuvent également être facilement extraites de la plaque TLC à l’aide d’une lame de rasoir, et le comptage de scintillation peut être utilisé pour quantifier la quantité de matériau radiomarqué dans la bande.
Ici, un protocole de radiomarquage polyvalent pour surveiller quantitativement la synthèse des espèces NL dans la levure est présenté. Ce protocole est très modulaire, ce qui permet de terminer la procédure dans les 3-6 jours. De plus, il existe une abondante littérature sur l’utilisation de la TLC pour séparer les espèces lipidiques et les métabolites, ce qui devrait permettre à l’utilisateur de détecter plusieurs espèces lipidiques d’intérêt avec un simple changement des systèmes de solvants TLC<s…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Henne pour leur aide et leurs conseils conceptuels dans la réalisation de cette étude. W.M.H. est soutenu par des fonds de la Welch Foundation (I-1873), du NIH NIGMS (GM119768), du Ara Paresghian Medical Research Fund et du UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R a été soutenu par une subvention du programme T32 (5T32GM008297).
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
GE Typhoon FLA9500 imager | |||
Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
Tricine | Sigma | T0377 | |
Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |