ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה
Summary
כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.
Abstract
שומנים ניטרליים (NLs) הם סוג של ביומולקולים הידרופוביים ללא תשלום הממלאים תפקידי מפתח באנרגיה והומאוסטזיס שומנים בדם. NLs הם מסונתז דה נובו מאצטיל-CoA והם נוכחים בעיקר אאוקריוטים בצורה של טריגליצרידים (TGs) ו אסטרים סטרול (SEs). האנזימים האחראים על הסינתזה של NLs נשמרים מאוד מ Saccharomyces cerevisiae (שמרים) לבני אדם, מה שהופך שמרים אורגניזם מודל שימושי לנתח את הפונקציה ואת הרגולציה של אנזימי חילוף החומרים NL. בעוד הרבה ידוע על איך אצטיל-CoA מומר קבוצה מגוונת של מינים NL, מנגנונים לוויסות אנזימי חילוף החומרים NL, וכיצד ויסות שגוי יכול לתרום פתולוגיות הסלולר, עדיין מתגלים. שיטות רבות לבידוד ואפיון של מינים NL פותחו ושימשו במשך עשרות שנים של מחקר; עם זאת, פרוטוקול כמותי ופשוט לאפיון מקיף של מינים NL גדולים לא נדון. כאן, שיטה פשוטה ומסתגלת לכמת את סינתזת דה נובו של מינים NL גדולים בשמרים מוצגת. אנו מיישמים 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשילוב עם כרומטוגרפיה שכבה דקה כדי להפריד ולכומת מגוון רחב של NLs חשוב מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד בשיעורי התגובה vivo של אנזימי NL או השפלה של מינים NL לאורך זמן.
Introduction
אצטיל-CoA הוא אבן הבניין הבסיסית של ביומולקולות מגוונות כולל שומנים ניטרליים (NLs), המשמשים מטבע ביומולקולרי רב-תכליתי לבניית ממברנות, יצירת ATP, ויסות איתות תאים1,2. הזמינות של NLs להיות מנודה לתוך כל אחד מהמסלולים האלה בהתאמה הוא, בחלקו, מוסדר על ידי האחסון שלהם. טיפות שומנים בדם (LDs), אברונים ציטופלסמיים המורכבים מלטיבות הידרופוביות של טריגליצרידים (TGs) ואסטרים סטרול (SEs), הם תאי האחסון העיקריים של רוב ה- NLs הסלולריים. ככזה, LDs לבודד ולווסת NLs, אשר ניתן להשפיל ולאחר מכן מנוצל לתהליכים ביוכימיים ומטבוליים3,4. זה ידוע כי הרגולציה השגויה של חלבונים הקשורים NL ו- LD מתואמת עם תחילת פתולוגיות כולל lipodystrophy ותסמונות מטבוליות5,6. בגלל זה, מחקר LD הנוכחי מתמקד מאוד על איך סינתזה NL מוסדר מרחבי, זמני, ועל פני רקמות נפרדות של אורגניזמים רב תאיים. בשל התפקידים התאיים בכל מקום עבור NLs, אנזימים רבים האחראים על סינתזה ורגולציה של NLs נשמרים ברחבי eukaryotes7. ואכן, אפילו כמה פרוקריוטים מאחסנים NLs ב- LDs8. לכן, אורגניזמים מודל מתיחה גנטית כגון Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים) היו שימושיים לחקר סינתזה ורגולציה NL.
ההפרדה וכימות של NLs מתמציות תאים ניתן לבצע במספר עצום של דרכים, כולל ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה גז (GC-MS), כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), וספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC-MS)9,10,11. אולי השיטה הפשוטה ביותר להפרדת NLs היא באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC), המאפשרת כימות צפיפות לאחר מכן מעקומה סטנדרטית12,13. למרות TLC מספק רק הפרדה מגורענת כמובן של NLs, זה נשאר טכניקה חזקה כי זה זול, וזה מאפשר הפרדה מהירה של NLs מכמה דגימות בו זמנית. שניים מהאתגרים הבולטים ביותר העומדים בפני המחקר של NLs באמצעות TLC הם: 1) המגוון הרחב של שפע תאי של מינים NL והמתווכים שלהם, ו -2) מגוון ההידרופיליות / הידרופוביה של מתווכים שומנים בתוך מסלולי סינתזה NL. כתוצאה מכך, הכימות של מינים NL באמצעות TLC מוגבל בדרך כלל למינים הנפוצים ביותר; עם זאת, הקדמה של 14C-חומצה אצטית radiolabel יכול לשפר באופן משמעותי את הזיהוי של מתווכים שפע נמוך בתוך מסלולי NL. חומצה אצטית מומרת במהירות לאצטיל-CoA על ידי אצטיל-CoA סינתטאז ACS214, מה שהופך 14חומצה C-אצטית מצע רדיובליבלי מתאים בשמרים15. בנוסף, הפרדה של NLs הידרופובית ומתווכים הידרופיליים של NLs ניתן להשיג על ידי TLC באמצעות מערכות ממס מרובות16. כאן, שיטה מוצגת להפרדה של NLs באמצעות 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשמרים. שומנים המסומנים במהלך תקופת הדופק מבודדים לאחר מכן על ידי פרוטוקול בידוד שומנים מוחלט מבוסס היטב17, ואחריו ההפרדה של מינים NL על ידי TLC. פיתוח לוחות TLC על ידי אוטורדיוגרפיה כדי לדמיין שומנים מסומנים, ותרסיס כימי כדי לדמיין שומנים מוחלטים, מאפשר שיטות מרובות של כימות. רצועות שומנים בודדות ניתן גם לחלץ בקלות מצלחת TLC באמצעות סכין גילוח, וספירת נוצץ יכול לשמש כדי לכמת את כמות החומר radiolabeled בתוך הלהקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, פרוטוקול radiolabeling תכליתי תכליתי כדי לפקח כמותית על הסינתזה של מינים NL בשמרים מוצג. פרוטוקול זה הוא מודולרי מאוד, המאפשר לסיים את ההליך בתוך 3-6 ימים. בנוסף, שפע של ספרות קיים על השימוש TLC להפריד מינים שומנים ומטבוליטים, אשר אמור לאפשר למשתמש לזהות כמה מינים שומנים של עניין עם שינוי פשוט של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדת חן על עזרה וייעוץ רעיוני בסיום מחקר זה. W.M.H. נתמך על ידי כספים מקרן וולש (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), קרן המחקר הרפואי Ara Paresghian, ותוכנית המלומדים UT Southwestern ניחן. S.R נתמך על ידי מענק תוכנית T32 (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
