Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

La acetil-CoA es el bloque de construcción fundamental de diversas biomoléculas, incluidos los lípidos neutros (ML), que sirven como una moneda biomolecular versátil para construir membranas, generar ATP y regular la señalización celular^1,2. La disponibilidad de NLs para ser desviados a cualquiera de estas vías respectivas está, en parte, regulada por su almacenamiento. Las gotas lipídicas (LDE), orgánulos citoplasmáticos compuestos por núcleos hidrofóbicos de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE), son los principales compartimentos de almacenamiento de la mayoría de las NEL celulares. Como tal, los LDE secuestran y regulan los NLs, que pueden ser degradados y posteriormente utilizados para procesos bioquímicos y metabólicos^3,4. Se sabe que la mala regulación de las proteínas asociadas a NL y LD se correlaciona con la aparición de patologías que incluyen lipodistrofia y síndromes metabólicos^5,6. Debido a esto, la investigación actual de LD se centra intensamente en cómo la síntesis de NL se regula espacialmente, temporalmente y a través de distintos tejidos de organismos multicelulares. Debido a las funciones celulares ubicuas para las NLs, muchas enzimas responsables de la síntesis y regulación de las NLs se conservan a lo largo de los eucariotas⁷. De hecho, incluso algunos procariotas almacenan NLs en LDs⁸. Por lo tanto, los organismos modelo genéticamente tratables como Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido útiles para el estudio de la síntesis y regulación de NL.

La separación y cuantificación de NLs de extractos celulares se puede lograr de muchas maneras, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas (UPLC-MS)^9,10,11. Quizás el método más simple para separar las NLs es a través de la cromatografía de capa delgada (TLC), que permite la cuantificación densitométrica posterior a partir de una curva estándar^12,13. Aunque TLC proporciona solo una separación de NLs de grano de curso, sigue siendo una técnica poderosa porque es económica y permite la rápida separación de NLs de varias muestras simultáneamente. Dos de los desafíos más considerables que enfrenta el estudio de las NL a través de TLC son: 1) la amplia gama de abundancias celulares de las especies de NL y sus intermedios, y 2) el rango de hidrofilicidad / hidrofobicidad de los intermedios lipídicos dentro de las vías de síntesis de NL. En consecuencia, la cuantificación de las especies nl a través de TLC se restringe típicamente a las especies más abundantes; sin embargo, la introducción de una radioetiqueta de ácido acético ¹⁴C puede mejorar significativamente la detección de intermedios de baja abundancia dentro de las vías NL. El ácido acético se convierte rápidamente en acetil-CoA por la acetil-CoA sintetasa ACS2^14,que hace que el ácido ¹⁴C-acético sea un sustrato de radiomarcado adecuado en^{levaduras 15}. Además, la separación tanto de las NLs hidrofóbicas como de los intermedios hidrófilos de las NLs puede lograrse mediante el uso de múltiples sistemas de disolventes¹⁶. Aquí, se presenta un método para la separación de NLs utilizando el etiquetado metabólico de ácido C-acético ¹⁴en levadura. Los lípidos etiquetados durante el período de pulso se aíslan posteriormente mediante un protocolo de aislamiento lipídico total bien establecido^17,seguido de la separación de las especies de NL por TLC. El desarrollo de placas TLC tanto por autoradiografía para visualizar lípidos etiquetados, como por un spray químico para visualizar lípidos totales, permite múltiples métodos de cuantificación. Las bandas lipídicas individuales también se pueden extraer fácilmente de la placa TLC utilizando una cuchilla de afeitar, y el conteo de centelleo se puede usar para cuantificar la cantidad de material radiomarcado dentro de la banda.