JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

Published: March 23, 2021
doi:
10.3791/62179
, ,
1Department of Internal Medicine,University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2German Center for Infection Research (DZIF), Hamburg-Lübeck-Borstel-Riems site, 3Research Department Virus Immunology,Leibniz Institute for Experimental Virology

Summary

يركز هذا البروتوكول على تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة وهو مناسب لترسب الكروماتين المناعي المتشابك (X-ChIP) متبوعا إما بتحليل PCR الكمي (X-ChIP-qPCR) أو نهج تسلسل الجيل التالي (X-ChIP-seq).

Abstract

الترسيب المناعي للكروماتين المتشابك (X-ChIP) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم مستويات علامات الهستون وإشغال عوامل النسخ على الكروماتين المضيف و / أو الممرض. يخلق تحضير الكروماتين من الأنسجة تحديات إضافية يجب التغلب عليها للحصول على بروتوكولات قابلة للتكرار وموثوقة مماثلة لتلك المستخدمة في زراعة الخلايا. يعد تعطيل الأنسجة وتثبيتها من الخطوات الحاسمة لتحقيق القص الفعال للكروماتين. قد يتطلب التعايش بين أنواع ومجموعات مختلفة من الخلايا أيضا أوقات قص مختلفة للوصول إلى الحجم الأمثل للشظية ويعيق قابلية تكرار القص. الغرض من هذه الطريقة هو تحقيق مستحضرات كروماتين مضيف موثوقة وقابلة للتكرار من الأنسجة المجمدة (الكبد) مناسبة لكل من تطبيقات ChIP-qPCR وتسلسل الجيل التالي (NGS). لاحظنا أن الجمع بين سحق أنسجة النيتروجين السائل متبوعا بالتجانس يؤدي إلى زيادة قابلية التكاثر مقارنة بالتجانس فقط ، لأنه يوفر تعليقا يتكون في الغالب من خلايا مفردة منفصلة يمكن قصها بكفاءة. علاوة على ذلك ، يجب إجراء خطوة التثبيت تحت دوران معتدل لتوفير تشابك متجانس. ثم تكون المادة الثابتة مناسبة لعزل النوى القائمة على المخزن المؤقت ، لتقليل تلوث البروتين السيتوبلازمي والحمض النووي الممرض والحمض النووي الريبي (عند الاقتضاء) ، وتجنب تدرجات الطرد المركزي التي تستغرق وقتا طويلا. ستكمل الصوتنة اللاحقة التحلل النووي وقص الكروماتين ، مما ينتج عنه نطاق حجم محدد وفقا لظروف القص المختارة. يجب أن يتراوح نطاق الحجم بين 100 و 300 nt لتطبيقات NGS ، بينما يمكن أن يكون أعلى (300-700 nt) لتحليل ChIP-qPCR. يمكن لمثل هذه التعديلات البروتوكولية أن تحسن بشكل كبير تحليلات الكروماتين من عينات الأنسجة المجمدة.

Introduction

منذ اكتشافه ، اكتسب التنظيم اللاجيني في خلايا الثدييات اعترافا متزايدا1 ، مع الأخذ في الاعتبار أن فهم مثل هذه الآليات سيوفر رؤى رئيسية ليس فقط في بيولوجيا الخلية ، ولكن أيضا في بيولوجيا المرض والأورام. علاوة على ذلك ، قد تسبب العوامل المعدية أيضا تغيرات جينية للمضيف2 في حين أن آلية الخلية المضيفة قد تؤثر أيضا على كروماتين مسببات الأمراض ، مثل فيروسات الحمض النووي المستمرة 3,4. يبدو أن هذا التفاعل بين المضيف والممرض يلعب دورا في استمرار العدوى. 2

من خلال الارتباط الانعكاسي مع الحمض النووي (DNA)، تشكل بروتينات الهستون مركبا يسمى النيوكليوسوم. تصل النيوكليوسومات بدورها إلى مستوى أعلى من التنظيم يعرف باسم الكروماتين. من المعروف أن إعادة تشكيل الكروماتين تنظم التعبير الجيني بإحكام ، وتمنح أو تمنع الوصول إلى عوامل النسخ (TFs)5. يمكن لهذه العوامل إما أن تؤدي أو تمنع تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي II (PolII) على محفزات الجينات ، مما يؤثر على تخليق mRNA من قالب الحمض النووي6. تحتوي بروتينات هيستون على ذيول7 ، تحيط بطرفي طية هيستون ، والتي يمكن أن تخضع لتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) ، مما يسمح بتنظيم محكم للنسخ الجيني عن طريق تغييرات الكروماتين الهيكلية. تقع معظم PTMs هيستون في نهاية الذيل N ، مع كون الأستلة والمثيلة أفضل PTMs المدروسة ، على الرغم من أن الفسفرة8 و ubiquitination9 و ribosylation10 قد تم الإبلاغ عنها أيضا. يعد توصيف هذه البروتينات ودراستها أمرا ضروريا للحصول على نظرة عميقة حول تنظيم الجينات.

يوجد حاليا عدد قليل من الأساليب والأدوات الراسخة المتاحة لدراسة التفاعلات المباشرة بين الحمض النووي والبروتين: مقايسة تحول الحركة الكهربائية (EMSA) ، ومقايسة الخميرة الهجينة الواحدة (Y1H) وبصمة الحمض النووي11. ومع ذلك ، تركز هذه الطرق في حد ذاتها على تفاعلات بروتين الحمض النووي الفردية ولا تنطبق على الدراسات على مستوى الجينوم. ومن القيود الأخرى على هذه التقنيات عدم وجود ارتباط هيستون مع أجزاء الحمض النووي التي تم فحصها. وبالتالي ، لا يقصد بهذه الأساليب أن تعكس تعقيد آلية النسخ في الجسم الحي ولا تأخذ في الاعتبار التغيرات الهيكلية المهمة12 أو غيرها من الإنزيمات / العوامل المساعدة المطلوبة13 التي يمكن أن تؤثر (إما تعزيز أو تثبيط) ارتباط البروتين بالحمض النووي.

فكرة أن تثبيت الخلايا بعوامل مثل الفورمالديهايد (FA) يمكن أن يوفر لقطة في الجسم الحي لتفاعلات البروتين والحمض النووي ، خلقت الأساس لتطوير مقايسات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) 14. هذا ، إلى جانب توافر تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) والأجسام المضادة المحددة للغاية ، سمح بتطوير مقايسات ChIP-qPCR. في وقت لاحق ، فإن ظهور تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS) ، التي أصبحت تكاليفها ميسورة التكلفة ، وافق على إقران تجارب ChIP مع مناهج NGS (ChIP-seq) ، وبالتالي تزويد الباحثين بأدوات قوية جديدة تمكن من التحقيق في تنظيم الكروماتين. في هذه المقايسات ، يتم تثبيت الخلايا المعزولة أو المستزرعة باستخدام غلوتارات ديسوسينيميديل (DSG) و / أو FA ، ويتم عزل النوى ، ثم يتم تجزئة الكروماتين وترسيبه بواسطة الجسم المضاد محل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم تنقية الحمض النووي وتحليله بواسطة طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو NGS. على عكس EMSA و Y1H وبصمة الحمض النووي ، فإن فحوصات ChIP لديها القدرة على توفير لقطة عالمية لتفاعل البروتين والحمض النووي داخل الخلية. وهذا يوفر المرونة ويسمح بتحليل مواقع متعددة داخل نفس العينة. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة الفحص ، قد يكتشف ChIP ، في النهاية ، ليس فقط التفاعلات المباشرة ، ولكن أيضا التفاعلات غير المباشرة ، ولا يقدم دقة الطرق المذكورة أعلاه ، عند الاهتمام بالتفاعلات المباشرة بين البروتين والحمض النووي.

بروتوكولات تحضير الكروماتين من مادة زراعة الخلايا راسخة15 وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، مما يسمح للمستخدم بالحصول على الكروماتين المناسب لكل من نهج qPCR و NGS في 1-2 أيام عمل. ومع ذلك ، فإن الحصول على كروماتين عالي الجودة من الأنسجة الكاملة لا يزال يمثل تحديا بسبب الحاجة إلى فصل الخلايا داخل الأنسجة مع تحقيق التثبيت الأمثل وقص الكروماتين. بالإضافة إلى ذلك ، يختلف تكوين ومورفولوجيا نوع متميز من الأنسجة ، مما يتطلب تعديل البروتوكولات الحالية16,17. يمثل استخدام الأنسجة المحفوظة بالتبريد تحديات إضافية مقارنة بالعينات الطازجة. ويرجع ذلك إلى صعوبة الحصول على تعليق خلية واحدة دون خسارة مادية واسعة النطاق. هذا يؤدي إلى القص غير السليم ، مما يعيق التطبيقات النهائية. ومع ذلك ، فإن الوصول إلى عينات الأنسجة المجمدة بدلا من نظيرتها الجديدة لا يزيد من مرونة العمل فحسب ، بل قد يمثل أيضا الخيار الوحيد للباحثين الذين يعملون مع العينات التي تنشأ من الدراسات الطولية أو المقارنة. تم نشر حفنة من بروتوكولات تحضير الكروماتين للأنسجة المجمدة. تعتمد هذه في الغالب على ذوبان العينة متبوعا بالفرم أو التفكك اليدوي / الآلي أو خطوات سحق النيتروجين السائل18،19،20.

هنا نصف طريقة تحضير الكروماتينالمحسنة 15 لعينات الكبد المجمدة غير الثابتة ، والتي تجمع بين سحق الأنسجة في النيتروجين السائل مع تجانس المدقة ، لتحقيق قص كروماتين قابل للتكرار مناسب لنهج X-ChIP التي تهدف إلى تحليل كل من الجينوم الفيروسي والمضيف.

Protocol

تم أخذ عينات الأنسجة من الفئران الوهمية الكبديةالبشرية 21 وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609 / EEC ووافقت عليه اللجنة الأخلاقية لمدينة وولاية هامبورغ وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. 1. إعداد الكواشف تحضير 1.25 م محلول جليكاين في ماء منزوع الأيونات. فلتر معقم بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تحضير محلول كلوريد الصوديوم 5 م (NaCl). يحفظ في درجة حرارة الغرفة. تحضير محلول CaCl 2: 300 mM CaCl2 و 10 mM Tris-HCl pH 8 في الماء منزوع الأيونات. فلتر معقم مع فلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر ويخزن في RT. تحضير تخفيف 10٪ Triton X-100 في الماء منزوع الأيونات. متجر في RT. تحضير المخزن المؤقت Tris-EDTA: 1 mM EDTA و 10 mM Tris pH 8 في الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية وفقا للمبلغ المطلوب:تحضير المخزن المؤقت A: 50 mM Hepes-KOH pH 7.5 ، 140 mM NaCl ، 1 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 10٪ Glycerol ، 0.5٪ NP-40 و 0.25٪ Triton X-100 في الماء منزوع الأيونات. فلتر معقم بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تحضير المخزن المؤقت B: 10 mM Tris-HCl pH 8 ، 200 mM NaCl ، 1mM EDTA ، 0.5 mM حمض egtazic (EGTA). فلتر معقم بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تحضير المخزن المؤقت C: 1٪ SDS ، 10 mM EDTA و 50 mM Tris-HCl pH 8 في الماء منزوع الأيونات. فلتر معقم بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. متجر في RT. تحضير محلول تخفيف الكروماتين: 0.01٪ SDS ، 1.1٪ Triton X-100 ، 1.2 mM EDTA ، 16.6 mM Tris-HCl pH 8 و 166 mM NaCl في الماء منزوع الأيونات. فلتر معقم بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. 2. إعداد المواد اجمع الثلج الجاف والثلج والنيتروجين السائل.تنبيه: تعامل مع الثلج الجاف والنيتروجين السائل بعناية فائقة لتجنب الحروق. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا عند 4 درجات مئوية.ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتجنب تدهور البروتين وفك الارتباط أثناء خطوات الغسيل لأن ذلك سيقلل من جودة الكروماتين. ضع صفيحة معقمة على الثلج الجاف واتركها تبرد.ملاحظة: تأكد من أن اللوحة كبيرة بما يكفي لتسهيل عملية القطع. يوصى باستخدام طبق زراعة / خلية بتري 100 مم. أخرج القسمة اللازمة من الجلايسين 1.25 متر واتركها تصل إلى RT. أخرج الحصص اللازمة من المخزن المؤقت A و B و PBS. أضف البروتياز و / أو مثبطات deacetylase والفوسفاتيز للوصول إلى تركيز 1 أضعاف واتركها على الجليد. أخرج القسمة اللازمة من المخزن المؤقت C واتركها في RT. لا تقم بإضافة الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات deacetylase والفوسفاتيز حتى يتم تحديدها. اخراج القسمة اللازمة من RT PBS.تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت C على كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). اعتماد تدابير السلامة المناسبة عند إعداد المخزن المؤقت.ملاحظة: يترسب SDS على الجليد ، ومثبطات الأنزيم البروتيني وديسيتيلاز غير مستقرة في RT. قم بتبريد الهاون الذي يصب النيتروجين السائل في غرفته مسبقا ، باتباع تعليمات المورد بدقة. برد المدقة المعدنية في الثلج الجاف لمدة 5 دقائق على الأقل.ملاحظة: من الممكن استخدام ملاط بديل للملاط المقترح. ومع ذلك ، فإن الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول ، بسبب بنائه الغريب ، يسمح بالعمل مع كمية صغيرة من الأنسجة دون خسارة كبيرة أثناء عملية السحق. قم بتبريد الخالط Dounce مسبقا باستخدام المدقة A المرتبطة به على الجليد.ملاحظة: المدقة أ لها ملاءمة فضفاضة مع الخالط. هذا يسمح بالحصول على تعليق خلية واحدة دون تحلل خلية كبير. 3. تشابك الأنسجة قطع حوالي 50 ملغ من الأنسجة المجمدة مباشرة على الطبق على الثلج الجاف بمساعدة مشرط وملاقط.ملاحظة: يقترح إبقاء المشرط في RT ، لأن ذلك سيسهل عملية القطع. تجنب الضغط كثيرا على المشرط ، لأن هذا سيزيد من خطر تشتيت قطع الأنسجة خارج منطقة القطع. تجدر الإشارة إلى أن 50 ملغ من الأنسجة (الكبد في هذه الحالة) يجب أن تنتج حوالي 5 ملايين خلية. لاحظ أن الشفرة الدافئة سوف تذوب حافة القطع. ومع ذلك ، بالنظر إلى الحجم الكبير نسبيا لقطعة الأنسجة ، يجب أن يكون لهذا تأثير محدود. عندما يتم قطع قطع أصغر ، قد يكون من المفيد استخدام مشرط بارد مع الانتباه لتجنب تشتت الأنسجة. ضع الأنسجة المقطوعة في أنبوب سعة 1.5 مل مبرد بالفعل على الثلج الجاف. تجنب إذابة الأنسجة. حرك الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة إلى الهاون ، واتركه هناك لمدة 5 دقائق.ملاحظة: ترك العينة ترتاح في الهاون يقلل من درجة حرارتها (من -80 درجة مئوية إلى -196 درجة مئوية). هذا يزيد من صلابتها ويجعل خطوة السحق أسهل. اضغط على العينة بمساعدة المدقة المبردة مسبقا حتى لا تظهر المزيد من الفتات الصلبة.ملاحظة: من المهم تجنب تسخين المدقة بواسطة قوى الدوران المفرطة ، لأن هذا سيؤدي إلى إذابة العينة. بعد كل سحق للعينة ، قم بتنظيف المدقة بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) واتركها تبرد مرة أخرى على الثلج الجاف. قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على العينة من الهاون وأضف 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة. ماصة بلطف صعودا وهبوطا حتى يتم إعادة العينة بالكامل. انتقل فورا إلى الخطوة 3.6. انقل تعليق الأنسجة إلى الخالط وقم بتطبيق 20-30 ضربة باستخدام المدقة A للحصول على تعليق أدق. تجنب الرغوة.ملاحظة: يجب تحسين كمية السكتات الدماغية وفقا لتناسق الأنسجة. هذه الخطوة تفصل بشكل أكبر المجموعات الصغيرة من الخلايا التي تم الحصول عليها بعد السحق. يمكن أن يؤثر التجانس غير السليم على كفاءة القص. انقل المجانس إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، مبرد بالفعل على الجليد. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1300 × جم عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات تماما في 950 ميكرولتر من RT PBS عن طريق السحب اللطيف وأضف 63.6 ميكرولتر من 16٪ FA الخالي من MeOH للحصول على تركيز نهائي بنسبة 1٪. انتقل فورا إلى الخطوة 3.10.تنبيه: FA مادة كيميائية سامة. تعامل معها تحت غطاء دخان مع تدابير السلامة المناسبة.ملاحظة: يمكن أن تؤدي إعادة التعليق غير المكتملة إلى تراكم الخلايا أثناء خطوة التثبيت. هذا يعيق التحلل وعملية القص. قم بالتدوير لمدة 10 دقائق في RT. تابع بعد ذلك على الفور إلى الخطوة 3.11ملاحظة: الدوران ضروري لتجنب الركام. يجب تحسين مقدار الوقت اللازم للتثبيت ، وفقا لهدف الاهتمام ونوع العينة. من المهم ملاحظة أن أوقات التثبيت المفرطة يمكن أن تعيق القص المناسب. أضف 113 ميكرولتر من 1.25 م جليكاين في RT للحصول على تركيز نهائي 125 مللي متر وقم بالتدوير لمدة 5 دقائق.ملاحظة: يروي الجلايسين التفاعل المثبت ويتجنب الإفراط في التشابك. جهاز طرد مركزي عند 1300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بعناية عن طريق سحب 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة. جهاز طرد مركزي عند 1300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر الخطوات 3.13-3.14 وانتقل فورا إلى خطوات عزل الكروماتين. 4. عزل الكروماتين أضف 950 ميكرولتر من المخزن المؤقت A مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات. تخلط برفق عن طريق سحب الحبيبات حتى يتم إعادة تعليق الحبيبات تماما وتدويرها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بتحليل تعليق الخلية المفردة الثابتة ، بدون تحلل النوى. هذا يسمح بتخليص عينة البروتينات الخلوية والحمض النووي الريبي. يمكن أن يكون إطالة وقت التحلل مفيدا للخلايا التي يصعب تحللها ، مما يزيد من وقت معالجة الأنسجة. في هذه المرحلة ، من الممكن التحقق من التحضير تحت المجهر بعد تلطيخ التريبان الأزرق / DAPI للتحقق من حجم المجموعات ووجود خلايا مفردة. ومع ذلك ، قد لا يكون من السهل تقدير النوى المفردة بسبب مادة الأنسجة الثابتة. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 950 ميكرولتر من المخزن المؤقت B مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات. تخلط برفق عن طريق سحب الحبيبات حتى يتم إعادة تعليق الحبيبات تماما وتدويرها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على غسل المخزن المؤقت للتحلل من تحضير النوى لتجنب المزيد من التحلل غير المرغوب فيه. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، أضف المثبطات المطلوبة (مثل الخطوة 2.5) إلى المخزن المؤقت C. إزالة بعناية طفا. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت RT C إلى الحبيبات والماصة بقوة. دوامة العينة لمدة 15-30 ثانية وتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع القطرات على الغطاء.ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتحرير وتحلل النوى الثابتة. للحفاظ على سلامة العينة وفي نفس الوقت تجنب هطول الأمطار SDS ، احتفظ بالعينة قبل صوتنة في رف بلاستيكي محفوظ على الجليد للحفاظ على درجة حرارة 9-11 درجة مئوية. 5. تجزئة الكروماتين انقل العينة إلى ثلاثة أنابيب نظيفة معتمدة من الصوتنة سعة 0.65 مل لضمان 100 ميكرولتر من معلق النوى المحللة لكل أنبوب.ملاحظة: من الممكن استخدام أنابيب معتمدة من صوتنة 1.5 مل بحد أقصى 300 ميكرولتر. هناك حاجة إلى حامل محدد لتلك الأنابيب. يجب أن يوفر 0.65 مل قصا أكثر تجانسا بسبب الحجم الأصغر للعينة لكل أنبوب. قم بتنشيط الكروماتين لمدة 28 دورة بكثافة عالية مع إعداد 30 s ON و 30 s OFF. تأكد من تبريد حمام الصوتنة بشكل صحيح (جهاز ثلج أو تبريد).ملاحظة: تحتاج هذه الخطوة إلى التحسين في كل حالة تقريبا. يجب على المستخدم أن يضع في اعتباره أن زيادة وقت القص سيوفر شظايا أصغر وأكثر تجانسا ؛ ومع ذلك ، قد يزيد هذا من فرصة خفض جودة الكروماتين. اختر أقل عدد من الدورات التي توفر حجم الجزء المطلوب. أثناء تحسين هذه الخطوة ، من المفيد إجراء تلطيخ نووي للتحقق مما إذا كان عدد الدورات كافيا لتحلل غالبية النوى. انقل الكروماتين الصوتي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل تم تبريده مسبقا على الجليد. أضف 30 ميكرولتر من محلول Triton X-100 10٪ ودوامة لمدة 5-10 ثوان.ملاحظة: يربط Triton X-100 SDS مما يمنع المزيد من هطول الأمطار عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون المبلغ النهائي من Triton X-100 دائما 1٪. أجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل مبرد مسبقا على الثلج. ملاحظة: يحتوي الطافي على الكروماتين المقطوع ويجب أن يظهر واضحا. تحتوي الحبيبات على مساند “غير قابلة للقص” ويجب أن تظل صغيرة جدا (معظمها بنية اللون في حالة أنسجة الكبد). ابحث عن إشارة إلى القص غير الناجح: محلول الكروماتين الذي لم يصبح أكثر وضوحا وأبعاد الحبيبات مماثلة لتلك الموجودة في الخطوة 4.5. 6. تنقية الحمض النووي انقل 10-25 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم إلى أنبوب جديد وأضف المخزن المؤقت C للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. قم بتخزين باقي الكروماتين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. إذا لزم الأمر ، يمكن مقاطعة الإجراء في هذه الخطوة وتخزين العينة عند -20 درجة مئوية. أضف 8 ميكرولتر من 5 M NaCl واحتضان 6 ساعات على الأقل عند 65 درجة مئوية في كتلة تسخين تحت الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة.ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بإلغاء ربط الكروماتين. من الأكثر أمانا تمديد فك الارتباط بين عشية وضحاها عندما يكون ذلك ممكنا. وجود كلوريد الصوديوم يجعل العملية أكثر كفاءة. دع العينات تبرد عند RT لمدة 5 دقائق وأضف 2 ميكرولتر من RNase A. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. قم بإزالة العينات من كتلة التسخين وأضف 7 ميكرولتر من 300 mM CaCl2 و 2 μL من Proteinase K. اضبط كتلة التسخين على 56 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة تحت الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد أنبوب فصل طور واحد لكل عينة عن طريق الطرد المركزي لها عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية.ملاحظة: هذه الأنابيب الخاصة تجعل فصل الطور أثناء استخراج فينول كلوروفورم الحمض النووي أسهل. قم بإزالة الأنابيب من كتلة التسخين واتركها تتوازن عند RT لمدة 3 دقائق. نقل 400 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب فصل الطور بالطرد المركزي سابقا. أضف 400 ميكرولتر من محلول كحول الفينول كلوروفورم إيزو أميل (PCI) والدوامة لمدة 5 ثوان.تنبيه: PCI مركب شديد التقلب وسام. يرجى التعامل معها مع تدابير السلامة اللازمة تحت غطاء الدخان. جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة 5 ثوان.تنبيه: الكلوروفورم مركب شديد التقلب وسام. يرجى التعامل معها مع تدابير السلامة اللازمة تحت غطاء الدخان.ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على التخلص من المخلفات المحتملة للفينول ، والتي يمكن أن تتداخل مع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائية. جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل 400 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل حيث تمت إضافة 24 ميكرولتر من 5 M NaCl و 0.75 μL من الجليكوجين. دوامة لفترة وجيزة. أضف 1055 ميكرولتر من 100٪ EtOH ودوامة جيدا. ضمان الخلط السليم. احتضان في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ON).ملاحظة: هذه الخطوة تعجل الحمض النووي المقطوع. لتعظيم العائد يقترح اختيار حضانة ON. أجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية مع الانتباه إلى عدم خلع الحبيبات. أضف 500 ميكرولتر من البرد 70٪ EtOH. قم بإمالة الأنبوب برفق لضمان غسل الحبيبات.ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة بقايا الملح التي يمكن أن تكون قد ترسبت مع الأحماض النووية. يمكن أن تتداخل الأملاح مع تطبيقات المصب الأخرى. أجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بالكامل بعناية واترك الحبيبات تجف في RT.ملاحظة: إن احتضان الأنبوب على كتلة تسخين عند 37 درجة مئوية سيقلل من الوقت اللازم للتجفيف. أضف 50 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA (TE-Buffer) وضع الأنبوب على كتلة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق تحت الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة.ملاحظة: تضمن هذه الخطوة إذابة الحبيبات. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين العينة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع أو عند -20 درجة مئوية لتخزين أطول. إجراء تحليل الحمض النووي على 1 ٪ هلام الاغاروز. 7. تحليل حجم الحمض النووي قم بإعداد جل أغاروز 1٪ عن طريق خلط 1 جم من الأغاروز لكل 100 مل من المخزن المؤقت (أي Tris-acetate-EDTA (TAE) أو Tris-borate-EDTA (TBE)). تسخين التعليق حتى يذوب الأغاروز تماما. أضف 10 ميكرولتر من EtBr لكل 100 مل من محلول الأغاروز قبل صب محلول الهلام.تنبيه: EtBr هو عامل إقحام الحمض النووي المعروف بأنه مسرطن. يرجى التعامل معها مع تدابير السلامة اللازمة تحت غطاء الدخان.ملاحظة: يقترح بشدة تلطيخ EtBr (مباشرة في هلام أو بعد الجري). لم يكن أداء الأصباغ الأخرى المقحمة للحمض النووي جيدا في أيدينا عند العمل مع مسحات الحمض النووي. توفر آبار التحميل الضيقة دقة أفضل عند مقارنتها بالآبار الأوسع. امزج 10 ميكرولتر من العينة مع 2 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x. بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة في الجل وقم بتشغيلها حتى يتم تشغيل الشريط الأخير من صبغة التحميل لمدة 2/3 من الجل. تأكد من إضافة سلم الحمض النووي. صور الجل وتحقق مما إذا كان حجم اللطاخة يقع في النطاق للتطبيق المطلوب.إذا اجتاز الكروماتين مراقبة الجودة ، فيمكن استخدامه للتطبيقات النهائية.

Representative Results

يعد تحضير الكروماتين خطوة حاسمة في تحقيق ChIP ناجح. من أجل تحضير كروماتين عالي الجودة من العينات المجمدة ، يجب أن نضمن تعطيل الأنسجة بكفاءة قبل التثبيت لتجنب وجود كتل الأنسجة التي يمكن أن تعيق القص الفعال. يوضح الشكل 1 مسارا موجزا للبروتوكول. لا يكفي السحق وحده لفصل الأنسجة تماما لأنه ينتج مجموعات خلايا متغيرة الحجم وعدد قليل من الخلايا المفردة (الشكل 1 أ). بربط خطوة السحق الأولى بتجانس Dounce ، يتم تقليل كمية كتل الأنسجة بشدة والباقي أصغر (الشكل 1 ب). بعد خطوات التثبيت والتحلل ، يزداد عدد النوى المفردة المرئية (الشكل 1 ج) ، بينما يفقد المظهر الكروي النموذجي. بعد صوتنة لمدة 28 دورة ، تلطيخ النووي (Hoechst 33258 / DAPI) هو في الغالب غير مرئي بعد الآن. هذه بالفعل علامة على نجاح القص (الشكل 1 د). بعد فك تشابك قسامة الكروماتين وتصور الحمض النووي على هلام الأغاروز ، يمكن التعرف على القص الناجح من خلال وجود شظايا في حدود 100-300 bp. (الشكل 2 أ) يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي وفقا لتكوين قطعة الأنسجة المعدة. يمكن استخدام هذا الكروماتين بنجاح ل ChIP-qPCR. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، يمكن ترسيب الكروماتين بنجاح باستخدام الأجسام المضادة H3K4me3 و H3K27ac (التعديلات المرتبطة بالجينات النشطة) و H3K27me3 (التعديل المرتبط بالجينات الصامتة). نتج عن مناطق تعزيز إطار القراءة المفتوح للكروموسوم 1 43 (C1orf43) والوحدة الفرعية للبروتيازوم 20S Beta 2 (PSMB2) ومناطق تعزيز نازعة هيدروجين الجلسرين ألدهيد 3 فوسفات (mGapdh) إثراء H3K4me3 و H3K27ac مقارنة ب Homeobox C13 (HOXC13) و Homeobox C12 (HOXC12) ومناطق تعزيز عامل نسخ المايلين 1 (mMyt1) (الجدول 1). وذلك لأن C1orf43 و PSMB2 و mGapdh يتم نسخها بشكل أساسي في الكبد ، بينما يتم إسكات HOXC13 و HOXC12 و mMyt1. يظهر H3K27me3 السلوك المعاكس الذي يؤكد نجاح مقايسة ChIP. حقيقة أن كبد هذه الفئران هو وهم ، سمح لنا بتحليل كل من الفئران والكروماتين البشري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام نفس الكروماتين بنجاح في تجارب ChIP-seq. بعد خطوة التسلسل ، تمت محاذاة القراءات إلى فهرس يتكون من كل من الفئران والجينومات البشرية لتقليل كمية الأجزاء غير المحاذية. بعد ذلك ، يتم فصل القراءات وفقا للأنواع وتحليلها بشكل أكبر باستخدام EaSeq22 . ثم تم قياس شدة الإشارة في موقع بدء النسخ (TSS) لكل جين وتم فرز النتيجة لشدة إشارة H3K4me3. يوضح الشكل 3 أ والشكل 3 ج وجودا ملحوظا ل H3K4me3 و H3K27ac في TSS لجزء كبير من الجينات داخل كل من الكروماتين الفأر والإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط مضاد H3K27me3 ب H3K4me3 / H3K27ac. H3K27me3 موجود على كامل طول الجين وليس فقط في TSS ، كما هو متوقع من PTM هذا. يوضح الشكل 3 ب والشكل3 د مجموعة HOXC / HoxC المعروفة بتخصيبها ل H3K27me3 وغير نشطة نسخيا في كل من كبد الفئران والإنسان. يظهر تنميط H3K4me3 و H3K27ac قمم هذين PTMs بينما تميل شدة إشارة H3K27me3 إلى أن تكون أقل وأكثر توزيعا. نظرا لتعقيد تحضير الكروماتين ، قد يحدث التثبيت الزائد ، وقد يكون وقت التحلل أو الصوتنة دون المستوى الأمثل ، وقد تستمر كتل الخلايا الكبيرة ، أو قد تكون المعالجة غير الكافية للعينة غير كافية. هذه كلها أحداث تؤثر على جودة التحضير. في بعض الحالات ، سيظل إثراء شظايا الكروماتين ضمن الحجم الصحيح موجودا أو سيتم نقله إلى حجم أعلى. في حالات أخرى ، قد يكون هناك فقدان للمواد بسبب التحلل المبكر أو القص غير الناجح. يوضح الشكل 4 بعض الأمثلة على هذه النتائج السلبية ودون المستوى الأمثل. يظهر الحارة 3 و 4 إثراء حجم الشظية بين 200 نقطة أساس و 800 نقطة أساس. ومع ذلك ، فمن الواضح أن حجم الشظية يمتد من 100 نقطة أساس إلى 10000 برميل >. في الحارة 5 و 6 ، يوجد تخصيب في نطاق 100-250 نقطة أساس مع فقدان واضح للمواد أثناء التحضير. هذا يمكن أن يفسر لماذا أنتجت صوتنة شظايا أصغر. يظهر الحارة 7 إعدادا دون المستوى الأمثل قليلا مع زيادة نطاق الشظايا ، بينما يظهر الحارة 8 فقدانا شبه كامل للمواد. يمكن أن يحدث هذا بسبب التحلل النووي المبكر أو تفكك الأنسجة غير الكافي مع ما يترتب على ذلك من فقدان بعد الخطوة 5.5. الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تحضير الكروماتين. تم التقاط الصور بعد سحق الأنسجة (أ) ، والتجانس اليدوي الإضافي (ب) ، وبعد التحلل النووي (ج) وبعد الصوتنة (قبل الطرد المركزي) (د). تم إجراء تلطيخ نووي باستخدام Hoechst 33258 / DAPI. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: قص الكروماتين التمثيلي ، وتقييم جودته بواسطة ChIP-qPCR. 1٪ هلام الأغاروز مع عينات الكروماتين المجزأة وفقا لبروتوكولات من مستحضرات الكروماتين المختلفة. تتم إضافة عنصر تحكم في الكروماتين غير المصقول لضمان عدم تدهور الكروماتين / الحمض النووي مسبقا (أ). تم اختبار الكروماتين المقطوع للتأكد من جودته في إجراء فحص ChIP-qPCR. تم استخدام الأجسام المضادة H3K4me3 و H3K27ac و H3K27me3 لترسيب الكروماتين الطازج. (ب) أجري تحليل qPCR على المروجين النشطين البشريين (C1orf43 و PSMB2) والفئران (Gapdh) والمروجين غير النشطين البشريين (HOXC13 و HOXC12) والفئران (Myt1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تحليل ChIP-seq التمثيلي. تمت محاذاة القراءات مع مؤشر تم إنشاؤه باستخدام كل من جينومات الإنسان والفأر (hg19 و mm10). بعد المحاذاة ، تم فصل القراءات البشرية والفئران وتحليلها بشكل أكبر. خريطة حرارية للجينات البشرية حيث تم قياس الإشارة في TSS وأظهرت بترتيب تنازلي لشدة H3K4me3 (a). مثال على مجموعة الجينات البشرية للجينات المكبوتة (مجموعة HOX) المحاطة بجينات نشطة (ب). خريطة حرارية لجينات الفئران حيث تم قياس الإشارة عند TSS وعرضها بترتيب تنازلي لشدة H3K4me3 (c). مثال على مجموعة جينات الفئران من الجينات المكبوتة (مجموعة Hox) المحاطة بجينات نشطة (د). تم تطبيع جميع البيانات المعروضة بواسطة EaSeq لكل مليون قراءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: مستحضرات الكروماتين دون المستوى الأمثل والفاشلة. 1٪ جل أغاروز مع عينات كروماتين مجزأة وفقا للبروتوكول. يحتوي الشكل على كروماتين غير مقطوع يستخدم كعنصر تحكم (الحارة 2) ، وليس القص الأمثل (الحارة 3-4) ، والقص الأمثل مع فقدان المواد الواضح (الحارة 5-6) ، والقص دون المستوى الأمثل (الحارة 7) وفقدان المواد على نطاق واسع (الحارة 8). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. اسم التمهيدي تسلسل C1orf43 المروج أمامي AGTGGGTGGAGAATGCAGAC عكس غاغاتاككاكاتك مروج PSMB2 أمامي CTTATTCAACCCCCGACAAA عكس GATGAAGGACGGTGAGAGGA HOXC13 المروج البعيد أمامي GAGCCCGAGATTCACTCAAC عكس TTATGCCCAGTTTTGGGGTA HOXC12 المروج البعيد أمامي AAAGCTTCCCACTGCAAAGA عكس AAATCTGGGGGCGAACTACT مروج mGAPDH أمامي GGTCCAAAGAGAGGAGAG عكس GCCCTGCTTATCCAGTCCTA مروج mMYT أمامي CAGCCCAATTCTAGCCACAT عكس CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG الجدول 1: قائمة بادئات qPCR للجينات النشطة وغير النشطة المستخدمة في فحوصات ChIP-qPCR.

Discussion

لا يزال تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة يمثل تحديا بسبب عدد الخطوات التي تحتاج إلى تحسين من أجل تحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. تتطلب معظم البروتوكولات المنشورة بالفعل16،23 فرم الأنسجة قبل التفكك اليدوي (الغسل). حاولنا تجنب الخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور البروتين قبل تثبيت العينة قدر الإمكان. تستخدم خطوة السحق بالفعل في مستحضرات الكبد المجمدة24 وتجعل التفكك اليدوي أسهل وقابل للتكرار (انظر الشكل 2 أ). باستخدام ملاط مصمم خصيصا لأنابيب 1.5 مل (انظر البروتوكولات) ، يتم تقليل فقدان العينة أثناء عملية السحق ، مما يسمح بمعالجة كميات صغيرة من الأنسجة مثل عينات خزعة الكبد. من حيث المبدأ ، من الممكن استخدام تجانس الأنسجة المباشر دون أي خطوات طحن ؛ ومع ذلك ، فإن تجانس الأنسجة دون سحق سابق له قابلية استنساخ أسوأ في تجربتنا وكان ظهور مشاكل للتطبيقات النهائية أعلى (البيانات غير معروضة).

معظم المشاكل التي يواجهها تحضير الكروماتين من الأنسجة مستمدة من طبيعة هذه العينات وعدم القدرة على التحقق بشكل صحيح مما إذا كانت مجموعات الخلايا صغيرة بما يكفي للتثبيت دون فقدان الجودة. علاوة على ذلك ، فإن التحقق من كل حصة في كل خطوة سيستغرق وقتا طويلا مما يزيد من فرصة تدهور البروتين.

التثبيت (الخطوة 3.9) هو جزء أساسي وحاسم من إعداد الكروماتين. نظرا لطبيعة الأنسجة ، تأخرت خطوة التثبيت حتى يتم تجانس الأنسجة. تتميز خطوة التثبيت المؤجلة هذه بميزة إنتاج تعليق خلية أكثر تجانسا. ومع ذلك ، فإننا ندرك أنه في حالة الأهداف الحساسة للتلاعب بشكل خاص ، قد يكون من الضروري إجراء التثبيت قبل الخطوة 3.6 مباشرة. هذا من شأنه أن يساعد في حماية البروتينات الحساسة للغاية أو PTMs ، على الرغم من أنه قد يزيد من حجم مجموعات الخلايا ، والتي عند تثبيتها قد تؤدي إلى قص غير متجانس. تركيز محلول FA المستخدم في البروتوكول قياسي ، ومع ذلك ، يمكن تعديله لمحاولة تحسين التثبيت العام. يعكس وقت التثبيت المختار هنا أيضا الظروف القياسية الشائعة الاستخدام في هذا المجال. في حالة التركيز العالي لمحلول التثبيت ، يمكن تقليل وقت التثبيت ، بينما في حالة وجود كمية أقل يجب زيادته. يجب على المشغل أن يأخذ في الاعتبار أن تغيير وقت التثبيت قد يؤدي إما إلى الإفراط في تثبيت العينة أو إفساح المجال لتحلل البروتين. في حالة استهداف ترسيب المجمعات الكبيرة (أو جزء منها) و TFs ، سيكون من المفيد إجراء تثبيت مزدوج الخطوة باستخدام حل DSG متبوعا ب FAواحد 25,26. DSG في هذه الحالة من شأنه أن يثبت تفاعلات البروتين والبروتين ، بينما يعمل الفورمالديهايد في الغالب على تفاعلات الحمض النووي والبروتينالمباشرة 27.

يجب على المشغل أن يأخذ في الاعتبار إمكانية تنفيذ مجموعة قائمة على العمود لتنقية الحمض النووي بدءا من الخطوة 6.7 وهي أسرع ولا تستخدم مركبات سامة. ومع ذلك ، سيكون هناك دائما قدر معين من الحمض النووي غير المرتبط الذي سيتم فقده. لهذا السبب ، نقترح استخدام استخلاص الفينول كلوروفورم الكلاسيكي متبوعا بترسيب EtOH. علاوة على ذلك ، قبل تشغيل هلام الأغاروز (الخطوة 7.2) ، قد يكون من المفيد قياس تركيز الحمض النووي وتحميل نفس الكمية لكل بئر للحصول على صورة أوضح.

ينبع أحد قيود هذا البروتوكول من حقيقة أننا استكشفنا هذا البروتوكول واستخدمناه فقط باستخدام عينات الكبد المشتقة من الفئران الخيمرية بين الإنسانوالكبد 28. في حد ذاته يتكون الكبد من النسيج الظهاري والضام29. في حالة المرض ، قد تكون الأنسجة الليفية والأنسجة الدهنية موجودة30,31 مما يخلق تحديات إضافية أثناء اضطراب الأنسجة. ومع ذلك ، فإننا ندرك أنه لا يجوز استخدام بروتوكولنا على العظام والعضلات والأنسجة الدهنية دون تحسين خطوات التفكك والصوتنة. تجدر الإشارة إلى أن كل نسيج يتطلب نوعا من التحسين بسبب عدم وجود بروتوكول مناسب لهم جميعا مثل عينات زراعة الخلايا15. ومع ذلك ، نعتقد أنه مع القليل من التحسين أو عدم التحسين على الإطلاق ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على الأنسجة الأخرى التي تشترك في أوجه التشابه مع الكبد في التكوين ، مثل الرئة أو الأمعاء أو المعدة أو البنكرياس أو أنسجة الكلى.

كما تم استخدام بروتوكولنا بنجاح لتحليل TFs وتعديلات الهستون على إبسوم الحمض النووي المغلق تساهميا HBV (cccDNA) 32. هذا يفتح الفرصة لتطبيق مثل هذا النهج على الجينومات الفيروسية الأخرى التي تؤثر على الكبد مثل الفيروس المضخم للخلاياالبشرية 33 (hCMV) والفيروسات الغدية البشرية34 (HAdV). لا يستبعد أنه سيكون من الممكن تحليل فيروسات الحمض النووي الأخرى التي تنشئ عدوى مستمرة في الأنسجة الأخرى مثل فيروس الهربس كابوسي ساركوما35 (KHSV) ، فيروس الهربس البسيط 36 (HSV1 / 2) فيروسات الورم ، فيروس إبشتاين بار37 (EBV).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) من خلال منحة إلى مورا داندري (SFB 841 A5) ومن قبل ولاية هامبورغ مع برنامج البحث (LFF-FV44: EPILOG).

نود أن نشكر الدكتور تاسيلو فولز وإيفون لاديجيس وأنيكا فولماري على المساعدة الفنية وعلى قراءة المخطوطة بشكل نقدي. الدكتور توماس غونتر والبروفيسور آدم جروندهوف لتقديمهما اقتراحات مفيدة للغاية ومجموعات التمهيدي لتحليل ChIP-qPCR.

Materials

0.22µm sterile syringe filter Labsolute 7699822
1.5 mL Safeseal tubes Sarstedt 7,27,06,400
6x orange loading dye Thermofisher R0631
Benchtop refrigerated centrifuge
Bioruptor NGS Diagenode
Blade or Scalpel
Calcium chloride dihydrate Carl Roth HN04
Chloroform Sigma Aldrich (Merck) C2432
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Deacetylase Inhibitor Active Motif 37494
Dounce tissue grinder set Sigma Aldrich (Merck) DWK885300-0001-1EA
EDTA 500 mM solution PanReac AppliChem A4892
EGTA Sigma Aldrich (Merck) E4378
EtBr Carl Roth 2218 Concentration 10mg/mL
Ethanol absolute CHEMSOLUTE 2273
Glycerol Sigma Aldrich (Merck) G9012
Glycin Carl Roth 0079
Glycogen Roche 10901393001 Concentration: 20mg/mL
Heating block
HEPES Sigma Aldrich (Merck) H4034
LE Agarose Biozym 840000
Liquid nitrogen cooled mini mortar Bel-Art H37260-0100
MeOH free Formaldehyde 16% Thermofisher 28908
NP-40 Roche 11332473001
PBS 1x Thermofisher 10010015
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor Sigma Aldrich (Merck) 11429868001
Phase Lock Gel – Heavy QuantaBio 2302830
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 Sigma Aldrich (Merck) P3803
Potassium chloride Carl Roth 6781
Potassium hydroxyde Merck 105033
Proteinase K Lucigen MPRK092 Concentration: 50 µg/µL
RNAse A Lucigen MRNA092 Concentration: 5 mg/mL
SDS 10% solution PanReac AppliChem A3950
Sodium carbonate anhydrous Carl Roth A135
Sodium chloride Sigma Aldrich (Merck) S7653
Sterile Petri dishes Sarstedt 83,39,02,500
Tris-HCl solution Sigma Aldrich (Merck) T2694
Triton-X100 Sigma Aldrich (Merck) X100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waddington, C. H., Pantelouris, E. M. Transplantation of nuclei in newt’s eggs. Nature. 172 (4388), 1050-1051 (1953).
  2. Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions. American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).
  3. Knipe, D. M., et al. Snapshots: chromatin control of viral infection. Virology. 435 (1), 141-156 (2013).
  4. Tropberger, P., et al. Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).
  5. Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes. Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).
  6. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 172-183 (2003).
  7. Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation. Genes & Development. 10 (6), 686-699 (1996).
  8. Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting. Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).
  9. Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).
  10. Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).
  11. Dey, B., et al. DNA-protein interactions: methods for detection and analysis. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).
  12. Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T. Transcription dynamics. Molecular Cell. 35 (6), 741-753 (2009).
  13. Nagy, Z., Tora, L. Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).
  14. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  15. Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis. Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).
  16. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).
  17. Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).
  18. Castellano-Castillo, D., et al. Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue. PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).
  19. Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).
  20. Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP method for tissue-specific gene targets. Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).
  21. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. 67 (3), 542-552 (2018).
  22. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).
  23. Perna, A., Alberi, L. A. TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).
  24. Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis. Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).
  25. Liu, Z., et al. Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation. Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).
  26. Singh, A. A., et al. Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors. Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).
  27. Aoki, T., et al. Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos. Fly. 8 (1), 43-51 (2014).
  28. Allweiss, L., Dandri, M. Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 64, 17-31 (2016).
  29. Krishna, M. Microscopic anatomy of the liver. Clinics in Liver Disease. 2, 4-7 (2013).
  30. Tannapfel, A., et al. Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease. Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).
  31. Schuppan, D., Afdhal, N. H. Liver cirrhosis. Lancet. 371 (9615), 838-851 (2008).
  32. Allweiss, L., et al. Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo. Gut. , 322571 (2021).
  33. Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors. Vaccines. 7 (3), (2019).
  34. Echavarria, M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 704-715 (2008).
  35. Frohlich, J., Grundhoff, A. Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease. Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).
  36. Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. The molecular basis of herpes simplex virus latency. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).
  37. Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection. Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).

Tags

Chromatin ExtractionChimeric LiverChromatin ImmunoprecipitationPBSHomogenizerCentrifugationFormaldehydeGlycineBuffer ABuffer B

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pirosu, A., Allweiss, L., Dandri, M. Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62179, doi:10.3791/62179 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image