クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

ヒト肝キメラマウス21 からの組織サンプリングは、欧州連合指令86/609/EECに従って実施され、ヘルシンキ宣言の原則に従ってハンブルク市および州の倫理委員会によって承認された。 1. 試薬の調製 脱イオン水中の1.25 Mグリシン溶液を調製します。0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 5 M塩化ナトリウム(NaCl)溶液を調製します。室温で保管してください。 CaCl2 溶液を調製する:脱イオン水中の300 mM CaCl2 および10 mM Tris-HCl pH 8。0.22 μmの細孔サイズのフィルターを備えた滅菌フィルターで、RTで保管します。 脱イオン水で10%Triton X-100希釈液を調製します。RTで保存してください。 トリス-EDTAバッファーを調製します:脱イオン水中で1 mM EDTAおよび10 mM Tris pH 8。4°Cで保存してください。 必要な量に応じて、次のバッファーを準備します。バッファーAを調製します:脱イオン水中の50 mM Hepes-KOH pH 7.5、140 mM NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、10%グリセロール、0.5%NP-40および0.25%トリトンX-100。0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 バッファーBを調製する:10 mM トリス塩酸 pH 8、200 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM エグタジン酸(EGTA)。0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 バッファーC:1%SDS、10 mM EDTA、および50 mM トリス塩酸pH 8を脱イオン水中で調製します。0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた滅菌フィルター。RTで保存してください。 クロマチン希釈バッファーを調製します:脱イオン水中で0.01%SDS、1.1%トリトンX-100、1.2 mM EDTA、16.6 mM トリス塩酸pH 8および166 mM NaCl。0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた滅菌フィルター。4°Cで保存してください。 2.材料の準備 ドライアイス、氷、液体窒素を収集します。注意: ドライアイスと液体窒素は、火傷をしないように必要な注意を払って取り扱ってください。 遠心分離機を4°Cで予冷します。注:このステップは、クロマチンの品質を低下させるため、洗浄ステップ中のタンパク質の分解と脱架橋を避けるために重要です。 滅菌プレートをドライアイスの上に置き、冷まします。注意: プレートが切断プロセスを容易にするのに十分な大きさであることを確認してください。100 mmのペトリプレート/細胞培養皿をお勧めします。 グリシン1.25 Mの必要なアリコートを取り出し、RTに到達させます。 バッファーA、B、PBSの必要なアリコートを取り出します。プロテアーゼおよび/またはデアセチラーゼおよびホスファターゼ阻害剤を1倍の濃度になるまで添加し、氷上に置いておきます。 必要なバッファーCのアリコートを取り出し、RTに残します。指定されるまで、プロテアーゼおよび/またはデアセチラーゼおよびホスファターゼ阻害剤を追加しないでください。. RT PBSの必要なアリコートを取り出します。注意: バッファー C には、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) が含まれています。バッファーを準備するときは、適切な安全対策を講じてください。注:SDSは氷上で沈殿し、プロテアーゼおよびデアセチラーゼ阻害剤はRTで安定していません。 チャンバー内に液体窒素を注ぐモルタルを予冷し、サプライヤーの指示に厳密に従ってください。金属乳棒をドライアイスで少なくとも5分間冷却します。注:提案されたモルタルに代わるモルタルを使用することは可能です。しかしながら、このプロトコルで使用される装置は、その独特の構造のために、粉砕プロセス中に実質的な損失なしに少量の組織で作業することを可能にする。 ダウンスホモジナイザーを関連する乳棒Aとともに氷上で事前に冷却します。注意: 乳棒Aはホモジナイザーとのゆるいフィット感を持っています。これにより、有意な細胞溶解なしに単一細胞懸濁液を得ることができる。 3.組織架橋 メスとピンセットを使ってドライアイスの上で皿の上で直接約50 mgの凍結組織を切ります。注:メスをRTに保つと、切断プロセスが容易になるため、メスをRTに保つことをお勧めします。メスに過度の圧力をかけると、切断領域の外側に組織片が散乱するリスクが高まるため、避けてください。注目すべきことに、50 mgの組織(この場合は肝臓)は約500万個の細胞を生み出すはずです。暖かい刃は刃先を解凍することに注意してください。ただし、組織片のサイズが比較的大きいことを考えると、効果は限られているはずです。小さな断片を切るときは、組織の飛散を避けるために注意を払いながら冷たいメスを使用することが有益かもしれません。 切り取ったティッシュを、ドライアイスで冷やした1.5mLチューブに入れます。組織の解凍を避けてください。 ティッシュが入っているチューブを乳鉢に移し、5分間そのままにします。注意: サンプルを乳鉢に入れておくと、サンプルの温度が下がります(-80°Cから-196°C)。これにより、靭性が向上し、粉砕ステップが容易になります。 固体の崩れが見えなくなるまで、事前に冷やした乳棒の助けを借りてサンプルに圧力をかけます。注意: サンプルが解凍されるため、過度の回転力による乳棒の加熱を避けることが重要です。すべてのサンプルを粉砕した後、乳棒を70%エタノール(EtOH)で洗浄し、ドライアイスで再び冷やします。 サンプルが入っているチューブを乳鉢から取り出し、必要な阻害剤を含む950 μLの氷冷PBSを加えます。サンプルが完全に再懸濁されるまで、ゆっくりと上下にピペットで固定します。すぐに手順 3.6 に進みます。 組織懸濁液をホモジナイザーに移し、乳棒Aで20〜30ストロークを適用して、より細かい懸濁液を得る。泡立ちを避けてください。注:ストローク量は、組織の一貫性に応じて最適化する必要があります。この工程は、粉砕後に得られた細胞の小さなクラスターをさらに解離させる。不適切な均質化は、せん断効率に影響を与える可能性があります。 ホモジネートを、すでに氷上で予冷した新しい1.5 mLチューブに移します。 4°Cで1,300 x g で5分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。 穏やかなピペッティングによりペレットを950 μLのRT PBSに完全に再懸濁し、63.6 μLの16%MeOHフリーFAを加えて最終濃度を1%にします。すぐに手順 3.10 に進みます。注意: FAは有毒な化学物質です。適切な安全対策を講じたドラフトの下で取り扱ってください。注:不完全な再懸濁は、固定ステップ中に細胞凝集を引き起こす可能性があります。これは溶解およびせん断プロセスを妨げる。 RTで10分回転します。すぐに手順3.11に進みます。注: 集計を避けるために回転が必要です。固定に必要な時間は、対象ターゲットとサンプルタイプに応じて最適化する必要があります。過度の固定時間は適切なせん断を妨げる可能性があることに注意することが重要です。 RTで113 μLの1.25 Mグリシンを加えて最終濃度125 mMとし、5分間回転させます。注:グリシンは固定反応を消光し、過剰架橋を回避します。 1,300 x g で 4 °C で 3 分間遠心分離します。 上清を廃棄し、必要な阻害剤を含む950 μLの氷冷PBSにピペッティングしてペレットを慎重に再懸濁します。 1,300 x g で 4 °C で 3 分間遠心分離します。 手順3.13〜3.14を繰り返し、すぐにクロマチン分離手順に進みます。 4. クロマチン単離 必要な阻害剤を含む950 μLのバッファーAをペレットに加えます。ペレットが完全に再懸濁するまでピペッティングで穏やかに混合し、4°Cで10分間回転させます。注:このステップでは、核溶解なしで固定単一細胞懸濁液を溶解します。これにより、細胞質タンパク質およびRNAのサンプルを取り除くことができます。溶解時間を長くすることは、溶解が困難な細胞にとって有益である可能性がありますが、組織の取り扱い時間が長くなります。この時点で、トリパンブルー/DAPI染色後の顕微鏡下で調製物を確認し、クラスターのサイズと単一細胞の存在を確認することができます。ただし、単一の核は、組織材料が固定されているため、簡単に理解できない場合があります。 2,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。 必要な阻害剤を含む950 μLのバッファーBをペレットに加えます。ペレットが完全に再懸濁するまでピペッティングで穏やかに混合し、4°Cで10分間回転させます。注:このステップでは、核調製物から溶解バッファーを洗い流して、さらなる望ましくない溶解を回避します。 2000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 一方、必要な阻害剤(ステップ2.5と同じ)をバッファーCに追加します。 上清を慎重に取り除きます。 300 μLのRTバッファーCをペレットに加え、激しくピペットで移します。 サンプルを15〜30秒間ボルテックスし、チューブを短時間回転させて蓋の液滴を収集します。注:このステップは、固定核を遊離して溶解するために重要です。サンプルの完全性を維持し、同時にSDS沈殿を避けるために、9-11°Cの温度を維持するために氷上に保たれたプラスチックラックに超音波処理の前にサンプルを保管してください。 5. クロマチン断片化 サンプルを3つのきれいな0.65 mL超音波処理認定チューブに移し、チューブあたり100 μLの溶解核懸濁液を確保します。注:最大容量300μLの1.5mL超音波処理認定チューブを使用することができます。これらのチューブには特定のホルダーが必要です。0.65 mLは、チューブあたりのサンプル量が少ないため、より均質なせん断を提供します。 クロマチンを30秒オンと30秒オフの設定で高強度で28サイクル超音波処理します。超音波処理器バスが適切に冷却されていることを確認してください(氷または冷却装置)。注: この手順は、ほとんどの場合、最適化が必要です。ユーザーは、せん断時間を増やすと、より小さく、より均質なフラグメントが得られることを覚えておく必要があります。ただし、これによりクロマチンの品質が低下する可能性が高くなります。必要なフラグメントサイズを提供する最小サイクル数を選択します。このステップの最適化中に、核染色を実行して、サイクル数が核の大部分を溶解するのに十分であったかどうかを確認することは有用です。 超音波処理されたクロマチンを、以前に氷上で冷却した新しい1.5mLチューブに移す。 30 μLのTriton X-100 10%溶液を加え、5〜10秒間ボルテックスします。注:Triton X-100はSDSに結合し、4°Cでのさらなる沈殿を防ぎます。 Triton X-100の最終量は常に1%でなければなりません。 16,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を氷上で予め冷やした清潔な1.5 mLチューブに移します。 注:上清には剪断されたクロマチンが含まれており、透明に見えるはずです。ペレットには「せん断できない」休息が含まれており、非常に小さいままである必要があります(肝臓組織の場合はほとんど茶色)。せん断の失敗の兆候を探します:クロマチン溶液が透明にならなかったこと、およびステップ4.5のものと同様のペレット寸法。 6. DNA精製 せん断クロマチン10〜25 μLを新しいチューブに移し、バッファーCを加えて最終容量200 μLにします。 残りのクロマチンは、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。必要に応じて、このステップで手順を中断し、サンプルを-20°Cで保存できます。 8 μLの5 M NaClを添加し、1000 rpmで振とうしながら加熱ブロック内で65°Cで少なくとも6時間インキュベートします。注:このステップでは、クロマチンを脱架橋します。可能であれば、脱架橋を一晩延長する方が安全です。NaClの存在はプロセスをより効率的にします。 サンプルをRTで5分間冷却し、2 μLのRNase Aを加えます。 1000 rpmで振とうしながら37°Cで1時間インキュベートします。 加熱ブロックからサンプルを取り出し、7 μLの300 mM CaCl 2と2 μLのプロテイナーゼKを加えます。 加熱ブロックを56°Cに設定し、1000rpmで振とうしながら30分間インキュベートします。一方、サンプルごとに1本の相分離チューブを準備し、16,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。注:これらの特別なチューブは、核酸フェノール-クロロホルム抽出中の相分離を容易にします。 加熱ブロックからチューブを取り外し、RTで3分間平衡化させます。 400 μLのサンプルを、予め遠心分離した相分離チューブに移します。 400 μLのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール溶液(PCI)を加え、5秒間ボルテックスします。注意: PCI は揮発性が高く毒性の高い化合物です。ドラフトの下で必要な安全対策を講じて取り扱ってください。 16,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 400 μLのクロロホルムとボルテックスを5秒間加えます。注意: クロロホルムは非常に揮発性で有毒な化合物です。ドラフトの下で必要な安全対策を講じて取り扱ってください。注:このステップは、ダウンストリームPCRアプリケーションを妨げる可能性のあるフェノールの残留物を洗い流します。 16,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 上相400 μLを新しい1.5 mLチューブに移し、そこで24 μLの5 M NaClと0.75 μLのグリコーゲンを添加しました。簡単に渦。 1,055 μLの100%EtOHを加え、完全にボルテックスします。適切な混合を確保してください。 -80°Cで1時間、または-20°Cで一晩(ON)インキュベートします。注:このステップは、剪断されたDNAを沈殿させます。収量を最大化するには、ONインキュベーションを選択することをお勧めします。 16,000 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。 ペレットを脱臼させないように注意しながら上清を慎重に除去します。 500 μLの冷たい70%EtOHを加えます。チューブを静かに傾けて、ペレットが確実に洗浄されるようにします。注:このステップは、核酸と共沈した可能性のある塩の残留物を除去するために不可欠です。塩は、他の下流の用途を妨げる可能性があります。 16,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清全体を慎重に取り除き、ペレットをRTで乾燥させます。注意: 37°Cの加熱ブロックでチューブをインキュベートすると、乾燥に必要な時間が短縮されます。 50 μLのトリス-EDTA溶液(TEバッファー)を加え、300 rpmで振とうしながら37°Cの加熱ブロックに5〜10分間チューブを置きます。注:このステップにより、ペレットの溶解が保証されます。プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは4°Cで最大1週間、または-20°Cで長期保存することができます。 1%アガロースゲルでDNA分析を行います。 7. DNAサイズ解析 ランニングバッファー100 mLあたり1 gのアガロース(酢酸トリス-EDTA(TAE)またはホウ酸トリス-EDTA(TBE))を混合して、1%アガロースゲルを調製します。アガロースが完全に溶解するまで懸濁液を加熱する。ゲル溶液を注ぐ前に、アガロース溶液100 mLごとに10 μLのEtBrを加えます。注意:EtBrは、発がん性があることが知られているDNA挿入剤です。ドラフトの下で必要な安全対策を講じて取り扱ってください。注:EtBr染色(ゲル中で直接または実行後)を強く推奨します。他のDNAインターカレート色素は、DNA塗抹標本を扱うときに私たちの手の中でうまく機能しませんでした。狭いローディングウェルは、幅の広いウェルと比較してより良い解像度を提供します。 10 μLのサンプルを2 μLの6xローディングダイと混合します。次に、10 μLのサンプルをゲルにロードし、ローディング色素の最後のバンドがゲルの2/3になるまで実行します。必ずDNAラダーを追加してください。 ゲルを画像化し、塗抹標本のサイズが目的の用途の範囲内にあるかどうかを確認します。クロマチンが品質管理に合格した場合、ダウンストリームアプリケーションに使用できます。