Этот протокол фокусируется на получении хроматина из замороженных тканей и подходит для иммунопреципитации сшивающего хроматина (X-ChIP) с последующим количественным анализом ПЦР (X-ChIP-qPCR) или подходами к секвенированию следующего поколения (X-ChIP-seq).
Сшивание иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) является широко используемым методом для оценки уровней гистоновых меток и занятости факторов транскрипции на хроматине хозяина и/или патогена. Получение хроматина из тканей создает дополнительные проблемы, которые необходимо преодолеть для получения воспроизводимых и надежных протоколов, сравнимых с теми, которые используются для культивирования клеток. Разрушение и фиксация тканей являются важными шагами для достижения эффективного сдвига хроматина. Сосуществование различных типов клеток и кластеров также может потребовать разного времени сдвига для достижения оптимального размера фрагмента и препятствует воспроизводимости сдвига. Целью этого метода является получение надежных и воспроизводимых препаратов хроматина хозяина из замороженной ткани (печени), пригодных как для ChIP-qPCR, так и для секвенирования следующего поколения (NGS). Мы наблюдали, что комбинация измельчения тканей жидким азотом с последующей гомогенизацией приводит к повышенной воспроизводимости по сравнению только с гомогенизацией, поскольку она обеспечивает суспензию, состоящую в основном из диссоциированных одиночных клеток, которые могут быть эффективно срезаны. Кроме того, этап фиксации должен выполняться при мягком вращении, чтобы обеспечить однородную сшивку. Затем фиксированный материал пригоден для выделения ядер на основе буфера, чтобы уменьшить загрязнение цитоплазматического белка и патогенных ДНК и РНК (если применимо), избегая трудоемких градиентов центрифугирования. Последующая обработка ультразвуком завершит ядерный лизис и сдвиг хроматина, производя определенный диапазон размеров в соответствии с выбранными условиями сдвига. Диапазон размеров должен составлять от 100 до 300 нт для приложений NGS, в то время как для анализа ChIP-qPCR он может быть выше (300-700 нт). Такая адаптация протокола может значительно улучшить анализ хроматина из замороженных образцов тканей.
С момента своего открытия эпигенетическая регуляция в клетках млекопитающих получает все большее признание1, учитывая, что понимание таких механизмов обеспечит ключевую информацию не только в клеточной биологии, но и в биологии болезней и опухолей. Кроме того, инфекционные агенты могут также вызывать эпигенетические изменения хозяина 2, тогда как механизмклетки-хозяина может также влиять на хроматин патогенов, таких как персистирующие ДНК-вирусы 3,4. Это взаимодействие хозяина и патогена, по-видимому, играет роль в персистенции инфекции. 2
Благодаря обратимой ассоциации с ДНК гистоновые белки образуют комплекс, называемый нуклеосомой. Нуклеосомы, в свою очередь, достигают более высокого уровня организации, известного как хроматин. Известно, что ремоделирование хроматина жестко регулирует экспрессию генов, предоставляя или отказывая в доступе к транскрипционным факторам (TF)5. Эти факторы могут либо запускать, либо блокировать рекрутирование РНК-полимеразы II (PolII) на промоторы генов, влияя на синтез мРНК из матрицыДНК 6. Гистоновые белки содержат хвосты7, фланкирующие оба конца гистоновой складки, которые могут подвергаться посттрансляционным модификациям (PTM), обеспечивая жесткую регуляцию транскрипции гена структурными изменениями хроматина. Большинство гистоновых PTM расположены на хвостовом N-конце, причем ацетилирование и метилирование являются наиболее изученными PTM, хотя также сообщалось о фосфорилировании8, убиквитинировании9 и рибозилировании10 . Характеристика и изучение таких белков необходимы для глубокого понимания регуляции генов.
В настоящее время существует несколько хорошо зарекомендовавших себя методов и инструментов для изучения прямых взаимодействий ДНК с белками: электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA), одногибридный анализ дрожжей (Y1H) и следы ДНК11. Однако эти методы сами по себе сосредоточены на единичных взаимодействиях ДНК-белка и неприменимы для полногеномных исследований. Другим ограничением этих методов является отсутствие ассоциации гистонов с исследуемыми сегментами ДНК. Таким образом, такие подходы не предназначены для отражения сложности транскрипционного механизма in vivo и не учитывают важные структурные изменения12 или другие необходимые ферменты/кофакторы13 , которые могут влиять (либо способствуя, либо ингибируя) связывание белка с ДНК.
Идея о том, что фиксация клеток с помощью таких агентов, как формальдегид (FA), может обеспечить in vivo снимок взаимодействий белка и ДНК, создала основу для разработки анализов иммунопреципитации хроматина (ChIP)14. Это, наряду с доступностью технологии количественной ПЦР (кПЦР) и высокоспецифичных антител, позволило разработать анализы ХИП-кПЦР. Впоследствии, появление методов секвенирования следующего поколения (NGS), стоимость которых становится все более доступной, позволило объединить эксперименты ChIP с подходами NGS (ChIP-seq), тем самым предоставив исследователям новые мощные инструменты, позволяющие исследовать регуляцию хроматина. В этих анализах изолированные или культивируемые клетки фиксируются с помощью дисукцинимидилглутарата (DSG) и/или FA, ядра выделяются, хроматин затем фрагментируется и осаждается интересующим антителом. Далее ДНК очищается и анализируется с помощью подходов ПЦР или NGS. В отличие от EMSA, Y1H и отпечатков ДНК, анализы ChIP способны обеспечить глобальный снимок взаимодействия белка с ДНК в клетке. Это обеспечивает гибкость и позволяет анализировать несколько локусов в одном образце. Однако, из-за характера анализа, ХИП может, в конечном итоге, обнаруживать не только прямые, но и косвенные взаимодействия, не предлагая точности вышеупомянутых методов, когда речь идет о прямых взаимодействиях белка с ДНК.
Протоколы получения хроматина из материала клеточной культуры хорошо зарекомендовали себя15 и обладают высокой воспроизводимостью, что позволяет пользователю получить хроматин, подходящий как для кПЦР, так и для NGS-подходов, за 1-2 рабочих дня. Тем не менее, получение высококачественного хроматина из целых тканей по-прежнему представляет собой проблему из-за необходимости диссоциации клеток внутри ткани при достижении оптимальной фиксации и сдвига хроматина. Кроме того, состав и морфология различных типов тканей варьируются, что требует корректировки существующих протоколов16,17. Использование криоконсервированной ткани создает дополнительные проблемы по сравнению со свежими образцами. Это связано с трудностью получения одноячеистой суспензии без обширных материальных потерь. Это приводит к неправильной резке, что затрудняет последующее применение. Тем не менее, доступ к замороженным образцам тканей, а не к свежим аналогам, не только повышает гибкость работы, но и может представлять собой единственный вариант для исследователей, работающих с образцами, полученными в результате продольных или сравнительных исследований. Было опубликовано несколько протоколов приготовления хроматина для замороженных тканей. Они в основном основаны на размораживании образца с последующим измельчением, ручной/машинной диссоциацией или измельчением жидким азотом на этапах18,19,20.
Здесь мы описываем оптимизированный методполучения хроматина 15 для замороженных нефиксированных образцов печени, который сочетает измельчение ткани в жидком азоте с гомогенизацией пестика для достижения воспроизводимого сдвига хроматина, подходящего для подходов X-ChIP, направленных на анализ как вирусных, так и хост-геномов.
Получение хроматина из замороженной ткани остается проблемой из-за количества этапов, которые необходимо оптимизировать для достижения воспроизводимых и надежных результатов. Большинство уже опубликованных протоколов16,23 требуют измельчения тканей перед ручной диссоциацией (дунтингом). Мы старались максимально избегать шагов, которые могли бы спровоцировать деградацию белка до фиксации образца. Стадия измельчения уже используется в замороженных препаратахпечени 24 и делает ручную диссоциацию более легкой и воспроизводимой (см. рис. 2а). При использовании раствора, специально разработанного для пробирок объемом 1,5 мл (см. Протоколы), потеря образца в процессе измельчения уменьшается, что позволяет обрабатывать небольшие количества ткани, такие как образцы биопсии печени. В принципе, можно использовать прямую гомогенизацию тканей без каких-либо этапов измельчения; Однако, по нашему опыту, гомогенизация тканей без предварительного измельчения имеет худшую воспроизводимость, и появление проблем для последующих применений было выше (данные не показаны).
Большинство проблем, возникающих при получении хроматина из тканей, связано с природой этих образцов и неспособностью должным образом проверить, достаточно ли малы клеточные кластеры для фиксации без потери качества. Более того, проверка каждой аликвоты на каждом этапе займет много времени, увеличивая вероятность деградации белка.
Фиксация (этап 3.9) является фундаментальной и важной частью подготовки хроматина. Из-за особенностей ткани этап фиксации был отложен до тех пор, пока ткань не будет гомогенизирована. Преимущество такой отложенной стадии фиксации заключается в получении более однородной клеточной суспензии. Тем не менее, мы признаем, что в случае особо чувствительных к манипуляциям целей может потребоваться выполнить фиксацию непосредственно перед шагом 3.6. Это поможет защитить чрезвычайно чувствительные белки или PTM, хотя это может увеличить размер клеточных кластеров, что при фиксации может привести к неоднородному сдвигу. Концентрация раствора ЖК, используемая в протоколе, является стандартной, однако ее можно модифицировать, чтобы попытаться улучшить общую фиксацию. Выбранное здесь время фиксации также отражает стандартные условия, обычно используемые в полевых условиях. В случае более высокой концентрации фиксирующего раствора время фиксации может быть уменьшено, а в случае меньшего количества его следует увеличить. Оператор должен учитывать, что изменение времени фиксации может либо привести к чрезмерной фиксации образца, либо создать место для деградации белка. В случае нацеливания на осаждение больших комплексов (или их части) и ТФ было бы целесообразно выполнить двухступенчатую фиксацию с использованием решения DSG с последующим FA25,26. DSG в этом случае стабилизирует белок-белковые взаимодействия, в то время как формальдегид действует в основном на прямые ДНК-белковые взаимодействия27.
Оператор должен учитывать возможность внедрения набора для очистки ДНК на основе колонки, начиная с шага 6.7, который является более быстрым и не использует токсичные соединения. Тем не менее, всегда будет определенное количество несвязанной ДНК, которая будет потеряна. По этой причине мы предлагаем использовать классическую фенол-хлороформную экстракцию с последующим осаждением EtOH. Кроме того, перед запуском агарозного геля (этап 7.2) может быть полезно измерить концентрацию ДНК и загрузить одинаковое количество для каждой лунки, чтобы иметь более четкую картину.
Ограничение этого протокола связано с тем, что мы исследовали и использовали этот протокол только с использованием образцов печени, полученных от химерных мышей28 печени человека. Сама по себе печень состоит из эпителиальной и соединительной ткани29. В случае заболевания может присутствовать фиброзная ткань и жировая ткань30,31, создавая дополнительные проблемы во время разрушения тканей. Тем не менее, мы признаем, что наш протокол не может быть использован на костной, мышечной и жировой ткани без оптимизации этапов диссоциации и обработки ультразвуком. Следует отметить, что каждая ткань требует некоторой оптимизации из-за отсутствия протокола, подходящего для всех из них, например, для образцовклеточных культур 15. Тем не менее, мы считаем, что с небольшой оптимизацией или вообще без нее этот протокол может быть успешно применен к другим тканям, которые имеют сходство с печенью по составу, таким как ткани легких, кишечника, желудка, поджелудочной железы или почек.
Наш протокол также был успешно использован для анализа TF и модификаций гистонов на ковалентно закрытой эписоме ДНК HBV (cccDNA)32. Это открывает возможность применить такой подход к другим вирусным геномам, влияющим на печень, таким как цитомегаловирус человека33 (hCMV) и аденовирусычеловека 34 (HAdV). Не исключено, что можно будет проанализировать другие ДНК-вирусы, которые устанавливают персистирующую инфекцию в других тканях, такие как вирус саркомыКапоши 35 (KHSV), вирус простого герпеса36 (HSV1/2), вирус Эпштейна-Барр37 (EBV).
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) грантом Мауры Дандри (SFB 841 A5) и землей Гамбург в рамках исследовательской программы (LFF-FV44: EPILOG).
Мы хотели бы поблагодарить доктора Тассило Фольца, Ивонн Ладигес и Аннику Вольмари за техническую помощь и критическое прочтение рукописи. Д-ру Томасу Гюнтеру и профессору Адаму Грундхоффу за предоставление очень полезных предложений и наборов праймеров для анализа ChIP-qPCR.
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |