Summary

Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

Published: February 11, 2021
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Summary

Nous présentons ici comment exposer le ganglion géniculé d’une souris de laboratoire vivante et anesthésiée et comment utiliser l’imagerie calcique pour mesurer les réponses d’ensembles de ces neurones aux stimuli gustatifs, permettant ainsi de multiples essais avec différents stimulants. Cela permet des comparaisons approfondies de quels neurones répondent à quels tastants.

Abstract

Au cours des dix dernières années, les progrès des indicateurs de calcium codés génétiquement (GECI) ont favorisé une révolution dans l’imagerie fonctionnelle in vivo. En utilisant le calcium comme indicateur de l’activité neuronale, ces techniques fournissent un moyen de surveiller les réponses des cellules individuelles au sein de grands ensembles neuronaux à une variété de stimuli en temps réel. Nous, et d’autres, avons appliqué ces techniques pour imager les réponses des neurones ganglionnaires géniculés individuels aux stimuli gustatifs appliqués aux langues de souris anesthésiées vivantes. Le ganglion géniculé est composé des corps cellulaires des neurones gustatifs innervant la langue antérieure et le palais ainsi que de certains neurones somatosensoriels innervant le pavillon de l’oreille. L’imagerie des réponses évoquées par le goût de neurones ganglionnaires géniculés individuels avec GCaMP a fourni des informations importantes sur les profils de réglage de ces neurones chez les souris de type sauvage ainsi qu’un moyen de détecter les phénotypes de mal câblage du goût périphérique chez les souris génétiquement manipulées. Ici, nous démontrons la procédure chirurgicale pour exposer le ganglion géniculé, l’acquisition d’images de fluorescence GCaMP, les étapes initiales pour l’analyse des données et le dépannage. Cette technique peut être utilisée avec des GCaMP codés transgéniquement, ou avec une expression GCaMP médiée par AAV, et peut être modifiée pour imager des sous-ensembles génétiques particuliers d’intérêt (c.-à-d. expression GCaMP médiée par Cre). Dans l’ensemble, l’imagerie calcique in vivo des neurones ganglionnaires géniculés est une technique puissante pour surveiller l’activité des neurones gustatifs périphériques et fournit des informations complémentaires aux enregistrements plus traditionnels des tympans de la corde du nerf entier ou aux tests de comportement gustatif.

Introduction

Un élément clé du système gustatif périphérique des mammifères est le ganglion géniculé. En plus de certains neurones somatosensoriels qui innervent le pavillon de l’oreille, le géniculé est composé des corps cellulaires des neurones gustatifs innervant la langue antérieure et le palais. Semblables à d’autres neurones sensoriels périphériques, les neurones ganglionnaires géniculés sont pseudo-unipolaires avec un long axone projetant périphériquement vers les papilles gustatives, et au centre du noyau du tronc cérébral du tractus solitaire1. Ces neurones sont activés principalement par la libération d’ATP par les cellules réceptrices du goût répondant aux stimuli gustatifs dans la cavité buccale2,3. L’ATP est un neurotransmetteur essentiel pour la signalisation du goût, et les récepteurs P2rx exprimés par les neurones ganglionnaires gustatifs sont nécessaires à leur activation4. Étant donné que les cellules réceptrices du goût expriment des récepteurs gustatifs spécifiques pour une modalité gustative particulière (sucré, amer, salé, umami ou acide), on a émis l’hypothèse que les réponses des neurones ganglionnaires gustatifs aux stimuli gustatifs seraient également étroitement accordées5.

Des enregistrements de nerfs entiers ont montré à la fois que la chorda tympani et les nerfs pétrosaux supérieurs plus grands conduisent des signaux gustatifs représentant les cinq modalités gustatives du ganglion géniculé6,7. Cependant, cela laissait encore des questions sur la spécificité des réponses neuronales à un tastant donné: s’il existe des neurones spécifiques à la modalité du goût, des neurones polymodaux ou un mélange des deux. Les enregistrements de fibres uniques donnent plus d’informations sur l’activité des fibres individuelles et leurs sensibilités chimiques8,9,10, mais cette méthodologie se limite à la collecte de données à partir d’un petit nombre de fibres. De même, les enregistrements électrophysiologiques in vivo de neurones ganglionnaires géniculés individuels de rats donnent des informations sur les réponses des neurones individuels11,12,13, mais perdent toujours l’activité de la population et produisent relativement peu d’enregistrements de neurones par animal. Afin d’analyser les schémas de réponse des ensembles neuronaux sans perdre de vue l’activité des neurones individuels, de nouvelles techniques devaient être utilisées.

L’imagerie calcique, en particulier en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés comme GCaMP, a fourni cette percée technique14,15,16,17,18. GCaMP utilise le calcium comme indicateur de l’activité neuronale, augmentant la fluorescence verte à mesure que les niveaux de calcium dans la cellule augmentent. De nouvelles formes de GCaMP continuent d’être développées pour améliorer le rapport signal/bruit, ajuster la cinétique de liaison et s’adapter aux expériences spécialisées19. GCaMP fournit une résolution de neurone unique, contrairement à l’enregistrement de nerfs entiers, et peut mesurer simultanément les réponses d’ensembles de neurones, contrairement à l’enregistrement d’une seule fibre ou d’une seule cellule. L’imagerie calcique des ganglions géniculés a déjà fourni des informations importantes sur les profils de réglage de ces neurones chez les souris de type sauvage16,20, et a identifié des phénotypes périphériques de mauvais câblage du goût chez des souris génétiquement manipulées18.

Une difficulté majeure à l’application de techniques d’imagerie calcique in vivo au ganglion géniculé est qu’il est encapsulé dans la bulle tympanique osseuse. Afin d’obtenir un accès optique au géniculé, une intervention chirurgicale délicate est nécessaire pour enlever les couches d’os, tout en gardant le ganglion intact. À cette fin, nous avons créé ce guide pour aider d’autres chercheurs à accéder au ganglion géniculé et à imager les réponses fluorescentes médiées par GCaMP de ces neurones pour goûter les stimuli in vivo.

Protocol

Les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à San Antonio. 1. Configuration préopératoire REMARQUE: Veuillez noter que la configuration initiale de l’équipement n’est pas abordée ici, car elle variera en fonction du système de pompe, du microscope, de la caméra et du logiciel d’imagerie utilisés. Pour obtenir des instructions d’installation…

Representative Results

Selon le protocole, un animal transgénique Snap25-GCaMP6s a été sédédé, des ganglions géniculés ont été exposés et un tastant a été appliqué sur la langue pendant l’enregistrement de la vidéo. Le but de l’expérience était de définir quels tastants suscitaient des réponses de chaque cellule. Les tastants (30 mM AceK, 5 mM quinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM d’acide citrique)18 ont été dissous dans de l’eau DI et ont été appliqués sur la langue pendant 2 …

Discussion

Ce travail décrit un protocole étape par étape pour exposer chirurgicalement le ganglion géniculé et enregistrer visuellement l’activité de ses neurones avec GCaMP6s. Cette procédure est très similaire à celle décrite précédemment17, à quelques exceptions notables près. Tout d’abord, l’utilisation d’un poteau de tête permet un ajustement facile du positionnement de la tête pendant la chirurgie. Deuxièmement, en ce qui concerne l’administration de stimuli, l’approche de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient S. Humayun pour l’élevage de souris. Le financement de ce travail a été fourni en partie par le Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) de l’UTSA et niH-SC2-GM130411 à L.J.M.

Materials

1 x #5 Inox Forceps Fine Science Tools NC9792102
1ml Syringe with luer lock Fisher Scientific 14-823-30
2 x #3 Inox Forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
27 Gauge Blunt Dispensing Needle Fisher Scientific NC1372532
3M Vetbond Fisher Scientific NC0398332
4-40 Machine Screw Hex Nuts Fastenere 3SNMS004C
4-40 Socket Head Cap Screw Fastenere 3SSCS04C004
Absorbent Points Fisher Scientific 50-930-668
Acesulfame K Fisher Scientific A149025G
Artificial Tears Akorn 59399-162-35
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle Fisher Scientific 14-829-6D
Blunt Retractors FST 18200-09
Breadboard Thor Labs MB8
Citric Acid Fisher Scientific A95-3
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Contemporary Ortho-Jet Liquid Lang 1504
Contemporary Ortho-Jet Powder Lang 1520
Cotton Tipped Applicators Fisher 19-062-616
Custom Head Post Holder eMachineShop See attached file 202410.ems
Custom Metal Head Post eMachineShop See attached file 202406.ems
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted Hamamatsu C13440
Disection Scope Leica M80
Hair Clippers Kent Scientific CL7300-Kit
IMP Fisher Scientific AAJ6195906
Ketamine Ketaved NDC 50989-996-06
LED Cold Light Source Leica Mcrosystems KL300LED
Luer Lock 1/16" Tubing Adapters Fisher 01-000-116
Microscope Olympus BX51WI
Mini-series Optical Posts Thorlabs MS2R
MPG Fisher Scientific AAA1723230
MXC-2.5 Rotatable probe Clamp Siskiyou 14030000E
NaCl Fisher Scientific 50-947-346
petri dishes Fisher Scientific FB0875713A
Pressurized air Airgas AI Z300
Quinine Fisher Scientific AC163720050
Self Sticking Labeling Tape Fisher Scientific 159015R
Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) Automate Scientific 05-14
Sola SM Light Engine Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D JAX 025111
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical Probe Roboz Surgical Store RS-6067
Surgical Probe Holder Roboz Surgical Store RS-6061
Thread Gütermann 02776
BD Intramedic Tubing Fisher Scientific 22-046941
Two Stage Gas Regulator Airgas Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing – 1/16" Automate Scientific 05-11
Valvelink8.2 digital/manual controller Automate Scientific 01-18
Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System Automate Scientific 17-pp-54
Xylazine Anased NADA# 139-236

References

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Cite This Article
Fowler, B. E., Macpherson, L. J. In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli. J. Vis. Exp. (168), e62172, doi:10.3791/62172 (2021).

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