في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس Geniculate استجابات الخلايا العصبية العقدية لتذوق المحفزات
Summary
هنا نقدم كيفية فضح العقدة geniculate من حية، مخدر الماوس المختبر وكيفية استخدام التصوير الكالسيوم لقياس استجابات مجموعات من هذه الخلايا العصبية لتذوق المحفزات، مما يسمح لتجارب متعددة مع المنشطات المختلفة. وهذا يسمح لمقارنات متعمقة من الخلايا العصبية التي تستجيب التي التي tastants.
Abstract
خلال السنوات العشر الماضية، عززت التطورات في مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ثورة في التصوير الوظيفي في الجسم الحي. باستخدام الكالسيوم كوكيل لنشاط الخلايا العصبية، توفر هذه التقنيات وسيلة لرصد استجابات الخلايا الفردية داخل مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة لمجموعة متنوعة من المحفزات في الوقت الحقيقي. نحن، وآخرون، قد طبقت هذه التقنيات لتصوير استجابات الخلايا العصبية العقدة geniculate الفردية لتذوق المحفزات المطبقة على ألسنة الفئران مخدر الحية. تتكون العقدة الجينية من أجسام الخلايا العصبية gustatory الداخلية اللسان الأمامي والحنك، فضلا عن بعض الخلايا العصبية الحسية سوماتوسوسي ت الداخلي بينا الأذن. وقد قدم تصوير الاستجابات التي أثارها الذوق من الخلايا العصبية العقدة geniculate الفردية مع GCaMP معلومات هامة حول ملامح ضبط هذه الخلايا العصبية في الفئران البرية من نوع فضلا عن وسيلة للكشف عن الأنماط الظاهرية الذوق المحيطي miswiring في الفئران التلاعب وراثيا. هنا نعرض الإجراء الجراحي لكشف العقدة الجينية ، واكتساب صورة GCaMP الفلورية ، والخطوات الأولية لتحليل البيانات ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. يمكن استخدام هذه التقنية مع GCaMP المشفرة وراثيا ، أو مع تعبير GCaMP بوساطة AAV ، ويمكن تعديلها لتصوير مجموعات فرعية وراثية معينة ذات أهمية (أي تعبير GCaMP بوساطة Cre). عموما، في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الخلايا العصبية العقدة geniculate هو تقنية قوية لرصد نشاط الخلايا العصبية gustatory الطرفية ويوفر معلومات تكميلية لتسجيلات أكثر تقليدية وتر العصب كله tympani أو المقايسات سلوك الذوق.
Introduction
أحد المكونات الرئيسية لنظام الذوق المحيطي للثدييات هو العقدة الجينية. بالإضافة إلى بعض الخلايا العصبية الحسية التي ت الداخلي بينا الأذن، ويتكون geniculate من أجسام الخلايا العصبية gustatory الداخلية اللسان الأمامي والحنك. على غرار الخلايا العصبية الحسية الطرفية الأخرى ، فإن الخلايا العصبية العقدية الجينية هي أحادية القطب الزائفة مع محور عصبي طويل إسقاط هامشيا لبراعم الذوق ، ومركزية إلى نواة جذع الدماغ في الجهاز الانفرادي1. يتم تنشيط هذه الخلايا العصبية في المقام الأول عن طريق الافراج عن ATP من قبل خلايا مستقبلات الذوق الاستجابة لمحفزات الذوق في تجويف الفم2,3. ATP هو ناقل عصبي أساسي للإشارات الذوق, ومستقبلات P2rx التي أعرب عنها الخلايا العصبية العقدة gustatory ضروريةلتفعيلها 4. وبالنظر إلى أن خلايا مستقبلات الذوق تعبر عن مستقبلات طعم محددة لصيغة طعم معين (الحلو، المر، المالحة، أومامي، أو الحامض)، فقد افترض أن استجابات الخلايا العصبية العقدية gustatory لمحفزات الذوق سيكون أيضا ضبطها بشقالأنفس 5.
وقد أظهرت تسجيلات الأعصاب كلها على حد سواء و chorda tympani والأعصاب بتروسال متفوقة أكبر إجراء إشارات gustatory تمثل جميع طرائق الذوق الخمسة إلى العقدة geniculate6،7. ومع ذلك، هذا لا يزال يترك أسئلة حول خصوصية الاستجابات العصبية لتسانت معين: إذا كان هناك طريقة الذوق الخلايا العصبية محددة، والخلايا العصبية متعددة الوسائط، أو خليط من كليهما. تسجيلات الألياف واحدة تعطي المزيد من المعلومات حول نشاط الألياف الفردية والحساسيات الكيميائية8،9،10، ولكن هذه المنهجية تقتصر على جمع البيانات من أعداد صغيرة من الألياف. وبالمثل، في التسجيلات الكهربية في الجسم الحي من الخلايا العصبية العقدة geniculate الفئران الفردية تعطي معلومات حول استجابات الخلايا العصبية الفردية11،12،13، ولكن لا يزال يفقد نشاط السكان وتسفر عن تسجيلات الخلايا العصبية قليلة نسبيا لكل. من أجل تحليل أنماط الاستجابة للفرق العصبية دون إغفال نشاط الخلايا العصبية الفردية، وتقنيات جديدة تحتاج إلى استخدامها.
وقد وفرت التصوير الكالسيوم، وخاصة باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل GCaMP، هذا الاختراق التقني14،15،16،17،18. يستخدم GCaMP الكالسيوم كوكيل لنشاط الخلايا العصبية ، مما يزيد من الفلورة الخضراء مع ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلية. أشكال جديدة من GCaMP لا تزال تتطور لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وضبط الحركية ملزمة، والتكيف مع التجارب المتخصصة19. يوفر GCaMP دقة خلية عصبية واحدة ، على عكس التسجيل العصبي بأكمله ، ويمكنه في وقت واحد قياس استجابات مجموعات الخلايا العصبية ، على عكس الألياف الفردية أو تسجيل الخلايا الواحدة. وقد قدم تصوير الكالسيوم من العقدة geniculate بالفعل معلومات هامة حول ملامح ضبط هذه الخلايا العصبية في الفئران البرية من النوع16،20، وحددت الذوق المحيطي miswiring الأنماط الظاهرية في الفئران التلاعب وراثيا18.
إحدى الصعوبات الرئيسية لتطبيق تقنيات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي على العقدة الجينية هي أنه مغلف داخل الثور التكتل العظمي. من أجل الحصول على الوصول البصري إلى geniculate ، مطلوب جراحة دقيقة لإزالة طبقات العظام ، مع الحفاظ على العقدة سليمة. لهذا الغرض، أنشأنا هذا الدليل لمساعدة الباحثين الآخرين على الوصول إلى العقدة الجينية وصورة استجابات GCaMP الفلورية بوساطة هذه الخلايا العصبية لتذوق المحفزات في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لفضح العقدة الجينية جراحيا وتسجيل نشاط خلاياها العصبية بصريا باستخدام GCaMP6s. هذا الإجراء مشابه جدا لتلك التي وصفت سابقا17، مع استثناءات ملحوظة قليلة. أولا ، استخدام منصب رئيس يسمح لتعديل سهل لتحديد المواقع في الرأس أثناء الجراحة. ثانيا، فيما ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون س. همايون على تربية الفئران. وقد تم توفير التمويل لهذا العمل جزئيا من قبل اتحاد صحة الدماغ UTSA خريج ومنحة بذور ما بعد الدكتوراه (B.E.F.) والمعاهد الوطنية للصحة-SC2-GM130411 إلى L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
