Summary

Dissociation cellulaire de l’épithélium de la langue et du mesenchyme/tissu conjonctif des souris embryonnaires de 12,5 et de 8 semaines

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

Nous avons développé un protocole généralisé pour dissocier une grande quantité de cellules simples de haute qualité de l’épithélium et du mesenchyme/tissu conjonctif des langues embryonnaires et adultes de souris.

Abstract

La dissociation cellulaire a été une procédure essentielle pour les études au niveau de chaque cellule et/ou au niveau de la population cellulaire (p. ex. séquençage de l’ARN unicellulaire et culture cellulaire primaire). Il est essentiel de produire des cellules viables et saines en grande quantité, et les conditions optimales pour le faire dépendent des tissus. Les populations cellulaires dans l’épithélium de la langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent sont hétérogènes et les structures tissulaires varient selon les régions et à différents stades de développement. Nous avons testé des protocoles pour isoler des cellules de l’épithélium de langue de souris et du mesenchyme/tissu conjonctif aux stades de développement précoce [jour embryonnaire 12.5 (E12.5)] et de jeune adulte (8 semaines). Une séparation propre entre l’épithélium et le mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux était facile à accomplir. Cependant, pour traiter et isoler davantage les cellules, il est essentiel de produire des cellules saines viables en grande quantité et de sélectionner soigneusement le tampon de digestion enzymatique, le temps d’incubation et la vitesse et le temps de centrifugation. L’incubation de l’épithélium séparé ou du mésenchyme/tissu conjonctif sous-jacent dans 0,25 % de Trypsine-EDTA pendant 30 min à 37 °C, suivie d’une centrifugation à 200 x g pendant 8 min a donné un rendement élevé de cellules à un taux de viabilité élevé (>90 %) quels que soient les stades de la souris et les régions de la langue. D’ailleurs, nous avons constaté que les cellules épithéliales dissociées et mesenchymal/conjonctif de tissu des langues embryonnaires et adultes pourraient survivre dans le milieu basé sur la culture cellulaire pendant au moins 3 h sans diminution significative de viabilité cellulaire. Les protocoles seront utiles pour les études qui nécessitent la préparation de cellules isolées à partir de langues de souris à des stades de développement précoce (E12.5) et de jeune adulte (8 semaines) nécessitant une dissociation cellulaire de différents compartiments tissulaires.

Introduction

La langue des mammifères est un organe complexe essentiel pour le goût, la parole et la transformation des aliments. Il est composé de plusieurs types de tissus fortement organisés compartimentés par le mesenchyme/tissu conjonctif et recouverts d’une feuille épithéliale stratifiée contenant des papilles gustatives et des papilles gustatives. Les populations de cellules dans l’épithélium de langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sont hétérogènes. Pour mieux comprendre les fonctions et la distribution d’un type particulier de cellules dans la langue, des études utilisant des cellules dissociées sont nécessaires. Par exemple, le séquençage de l’ARN unicellulaire est une méthode puissante et à haut débit pour le profilage transcriptomique dans des cellules individuelles, qui est conçue pour comprendre le transcriptome de tissus complexes à une résolution unicellulaire1,2,3,4. La culture cellulaire primaire s’est avérée être un outil utile pour étudier la fonction et la différenciation des cellules souches/progénitrices pour les papillesgustatives 5,6. Ces études nécessitent une grande quantité de populations de cellules isolées de haute qualité (p. ex. nombre total de cellules suffisant avec une concentration appropriée et une viabilité élevée).

Ainsi, il est nécessaire d’isoler les cellules de différentes régions des tissus linguaux et à différents stades de développement. Actuellement, il n’y a pas de protocole détaillé disponible pour la dissociation de cellules de l’épithélium de langue et du mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent. Ici, nous rapportons une méthode de dissociation cellulaire optimisée pour préparer les cellules à des expériences nécessitant une haute qualité de cellules vivantes telles que pour le séquençage de l’ARN unicellulaire et les cultures de cellules souches primaires. Nous avons constaté que la sélection du tampon de digestion enzymatique, le pipetage doux, la sélection du milieu de remise en suspension et le temps et la vitesse de centrifugation optimaux sont cruciaux pour générer ces grandes quantités de cellules de haute qualité.

Protocol

L’utilisation d’animaux (souris C57BL/6 tout au long de l’étude) a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie et était conforme aux lignes directrices des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux à des fins de recherche. 1. Utilisation des animaux REMARQUE: Les souris ont été élevées et maintenues dans l’installation animale du département des …

Representative Results

Séparation de l’épithélium de langue du mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacentDans la langue embryonnaire de souris, un espace dans l’espace sous-épithélial est visible après une digestion enzymatique appropriée. Les feuilles épithéliales de certaines langues sont séparées sans force mécanique pendant l’incubation. Dans la langue de souris adulte, une injection d’enzymes réussie est indiquée par le gonflement dans les zones injectées (<strong class=…

Discussion

Jusqu’ici, il n’y a pas eu de protocole détaillé disponible pour la dissociation de cellules de l’épithélium de langue et du mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux. Ce protocole actuel de dissociation cellulaire fournit une procédure reproductible pour générer une suspension cellulaire unique avec une viabilité cellulaire élevée (>90%) des tissus de langue de souris, y compris les feuilles épithéliales et les tissus mésenchymes/conjonctifs aux stades embryonnaire et postnatal, même si les cellules i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health, sous les numéros de subvention R01DC012308 et R21DC018089 à HXL. Nous remercions Brett Marshall (Université de Géorgie, Athènes, GA) et Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) pour l’assistance technique et la consultation concernant la dissociation cellulaire; à Francisca Gibson Burnley (Université de Géorgie, Athènes, GA) pour l’édition anglaise.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

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  2. Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
  3. Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
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  5. Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
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  9. Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).

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Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

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