Summary

Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.

Abstract

Диссоциация клеток была важной процедурой для исследований на уровне отдельных клеток и/или на уровне клеточной популяции (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичная клеточная культура). Получение жизнеспособных, здоровых клеток в больших количествах имеет решающее значение, и оптимальные условия для этого зависят от тканей. Клеточные популяции в эпителии языка и лежащей в его основе мезенхиме/ соединительной ткани являются гетерогенными, и тканевые структуры различаются в разных областях и на разных стадиях развития. Мы протестировали протоколы выделения клеток из эпителия языка мыши и мезенхимы/соединительной ткани на ранних стадиях развития [эмбриональный день 12,5 (E12,5)] и молодых взрослых (8 недель). Чистое разделение между эпителием и подлежащей мезенхимой/соединительной тканью было легко осуществить. Однако для дальнейшей обработки и изоляции клеток, дающих жизнеспособные здоровые клетки в больших количествах, и тщательный выбор ферментативного буфера пищеварения, времени инкубации и скорости и времени центрифугирования имеют решающее значение. Инкубация отделенного эпителия или подлежащей мезенхимы/соединительной ткани в 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 мин при 37 °C с последующим центрифугированием при 200 х г в течение 8 мин приводила к высокому выходу клеток при высокой скорости жизнеспособности (>90%) независимо от стадий мыши и областей языка. Более того, мы обнаружили, что как диссоциированные эпителиальные, так и мезенхимальные /соединительные клетки из эмбрионального и взрослого языков могут выживать в среде на основе клеточной культуры в течение не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Протоколы будут полезны для исследований, требующих подготовки изолированных клеток из языков мыши на ранних стадиях развития (E12.5) и молодых взрослых (8-недельных) стадиях, требующих диссоциации клеток из разных тканевых компартментов.

Introduction

Язык млекопитающих является сложным органом, критически важным для вкуса, речи и обработки пищи. Он состоит из нескольких типов высокоорганизованных тканей, разделенных мезенхимой / соединительной тканью и покрытых стратифицированным эпителиальным листом, содержащим вкусовые сосочки и вкусовые рецепторы. Клеточные популяции как в эпителии языка, так и в мезенхиме/соединительной ткани неоднородны. Чтобы лучше понять функции и распределение определенного типа клеток на языке, необходимы исследования с использованием диссоциированных клеток. Например, секвенирование одноклеточной РНК является мощным и высокопроизводительный методом транскриптомного профилирования в отдельных клетках, который предназначен для понимания транскриптома сложной ткани при одноклеточном разрешении1,2,3,4. Было доказано, что первичная клеточная культура является полезным инструментом для изучения функции и дифференцировки стволовых/прогениторных клеток для вкусовых рецепторов5,6. Эти исследования требуют большого количества высококачественных изолированных клеточных популяций (например, достаточное общее количество клеток при правильной концентрации и высокой жизнеспособности).

Таким образом, возникает необходимость выделения клеток из разных областей лингвальных тканей и на разных стадиях развития. В настоящее время не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Здесь мы сообщаем об оптимизированном методе диссоциации клеток для подготовки клеток к экспериментам, требующим высокого качества живых клеток, таких как секвенирование одноклеточной РНК и первичные культуры стволовых клеток. Мы обнаружили, что выбор ферментативного буфера пищеварения, щадящее пипетирование, выбор среды ресуспензии, а также оптимальное время и скорость центрифугирования имеют решающее значение для создания этих больших количеств высококачественных клеток.

Protocol

Использование животных (мыши C57BL/6 на протяжении всего исследования) было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Джорджии и соответствовало Руководящим принципам Национального института здравоохранения по уходу и использованию животны?…

Representative Results

Отделение эпителия языка от подлежащей мезенхимы/соединительной тканиВ эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов. Эпителиальные листы некоторых языков отделяются без механической силы во время инкуб…

Discussion

На сегодняшний день не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Этот протокол диссоциации текущих клеток обеспечивает воспроизводимую процедуру для создания одноклеточной суспензии с высокой жизне?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения, номер гранта R01DC012308 и R21DC018089 для HXL. Мы благодарим Бретта Маршалла (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) и Эгона Рангини (10X GENOMICS, Плезантон, Калифорния) за техническую помощь и консультации по поводу диссоциации клеток; Франциске Гибсон Бернли (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) для редактирования на английском языке.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

  1. Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
  2. Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
  3. Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  4. Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  5. Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  6. Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  7. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  8. Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
  9. Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

View Video