Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель
Summary
Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.
Abstract
Диссоциация клеток была важной процедурой для исследований на уровне отдельных клеток и/или на уровне клеточной популяции (например, секвенирование одноклеточной РНК и первичная клеточная культура). Получение жизнеспособных, здоровых клеток в больших количествах имеет решающее значение, и оптимальные условия для этого зависят от тканей. Клеточные популяции в эпителии языка и лежащей в его основе мезенхиме/ соединительной ткани являются гетерогенными, и тканевые структуры различаются в разных областях и на разных стадиях развития. Мы протестировали протоколы выделения клеток из эпителия языка мыши и мезенхимы/соединительной ткани на ранних стадиях развития [эмбриональный день 12,5 (E12,5)] и молодых взрослых (8 недель). Чистое разделение между эпителием и подлежащей мезенхимой/соединительной тканью было легко осуществить. Однако для дальнейшей обработки и изоляции клеток, дающих жизнеспособные здоровые клетки в больших количествах, и тщательный выбор ферментативного буфера пищеварения, времени инкубации и скорости и времени центрифугирования имеют решающее значение. Инкубация отделенного эпителия или подлежащей мезенхимы/соединительной ткани в 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 30 мин при 37 °C с последующим центрифугированием при 200 х г в течение 8 мин приводила к высокому выходу клеток при высокой скорости жизнеспособности (>90%) независимо от стадий мыши и областей языка. Более того, мы обнаружили, что как диссоциированные эпителиальные, так и мезенхимальные /соединительные клетки из эмбрионального и взрослого языков могут выживать в среде на основе клеточной культуры в течение не менее 3 ч без значительного снижения жизнеспособности клеток. Протоколы будут полезны для исследований, требующих подготовки изолированных клеток из языков мыши на ранних стадиях развития (E12.5) и молодых взрослых (8-недельных) стадиях, требующих диссоциации клеток из разных тканевых компартментов.
Introduction
Язык млекопитающих является сложным органом, критически важным для вкуса, речи и обработки пищи. Он состоит из нескольких типов высокоорганизованных тканей, разделенных мезенхимой / соединительной тканью и покрытых стратифицированным эпителиальным листом, содержащим вкусовые сосочки и вкусовые рецепторы. Клеточные популяции как в эпителии языка, так и в мезенхиме/соединительной ткани неоднородны. Чтобы лучше понять функции и распределение определенного типа клеток на языке, необходимы исследования с использованием диссоциированных клеток. Например, секвенирование одноклеточной РНК является мощным и высокопроизводительный методом транскриптомного профилирования в отдельных клетках, который предназначен для понимания транскриптома сложной ткани при одноклеточном разрешении1,2,3,4. Было доказано, что первичная клеточная культура является полезным инструментом для изучения функции и дифференцировки стволовых/прогениторных клеток для вкусовых рецепторов5,6. Эти исследования требуют большого количества высококачественных изолированных клеточных популяций (например, достаточное общее количество клеток при правильной концентрации и высокой жизнеспособности).
Таким образом, возникает необходимость выделения клеток из разных областей лингвальных тканей и на разных стадиях развития. В настоящее время не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Здесь мы сообщаем об оптимизированном методе диссоциации клеток для подготовки клеток к экспериментам, требующим высокого качества живых клеток, таких как секвенирование одноклеточной РНК и первичные культуры стволовых клеток. Мы обнаружили, что выбор ферментативного буфера пищеварения, щадящее пипетирование, выбор среды ресуспензии, а также оптимальное время и скорость центрифугирования имеют решающее значение для создания этих больших количеств высококачественных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
На сегодняшний день не существует подробного протокола диссоциации клеток от эпителия языка и лежащей в его основе мезенхимы / соединительной ткани. Этот протокол диссоциации текущих клеток обеспечивает воспроизводимую процедуру для создания одноклеточной суспензии с высокой жизне?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения, номер гранта R01DC012308 и R21DC018089 для HXL. Мы благодарим Бретта Маршалла (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) и Эгона Рангини (10X GENOMICS, Плезантон, Калифорния) за техническую помощь и консультации по поводу диссоциации клеток; Франциске Гибсон Бернли (Университет Джорджии, Афины, Джорджия) для редактирования на английском языке.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
