انفصال الخلايا عن ظهارة اللسان وميسينشيم/ النسيج الضام للفئران الجنينية في اليوم 12.5 و8 أسابيع
Summary
لقد قمنا بتطوير بروتوكول معمم لتفكيك كمية كبيرة من الخلايا المفردة عالية الجودة من الظهارة والأنسجة الميسنشيم / الضامة لألسنة الفئران الجنينية والبالغة.
Abstract
كان فصاغة الخلية إجراء أساسيا للدراسات على مستوى الخلية الفردية و/أو على مستوى مجموعة الخلايا (على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وثقافة الخلية الأولية). إن إنتاج خلايا سليمة وقابلة للحياة بكميات كبيرة أمر بالغ الأهمية، والظروف المثلى للقيام بذلك تعتمد على الأنسجة. مجموعات الخلايا في ظهارة اللسان والأنسجة الكامنة وراء mesenchyme / الضام هي غير متجانسة وهياكل الأنسجة تختلف في مناطق مختلفة وفي مراحل النمو المختلفة. لقد اختبرنا بروتوكولات لعزل الخلايا من ظهارة لسان الماوس والأنسجة الميسنشيمية / الضامة في النمو المبكر [اليوم الجنيني 12.5 (E12.5)] ومراحل الشباب البالغين (8 أسابيع). كان من السهل تحقيق فصل نظيف بين الظهارة والأنسجة الكامنة في mesenchyme / الضام. ومع ذلك، لمزيد من معالجة وعزل الخلايا، مما أسفر عن خلايا صحية قابلة للحياة بكميات كبيرة، والاختيار الدقيق لحاجز الهضم الأنزيمي، ووقت الحضانة، وسرعة الطرد المركزي والوقت أمر بالغ الأهمية. أدى احتضان الظهارة المنفصلة أو النسيج الميسنشيمي/الضام الأساسي في 0.25٪ تريبسين-إي دي تا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، يليه الطرد المركزي عند 200 × ز لمدة 8 دقائق إلى غلة عالية من الخلايا بمعدل صلاحية مرتفع (>90٪) بغض النظر عن مراحل الماوس ومناطق اللسان. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن كلا من الخلايا الظهارية والظهارية الملساء / الضامة من الألسنة الجنينية والبالغة يمكن البقاء على قيد الحياة في الوسط القائم على ثقافة الخلية لمدة 3 ساعة على الأقل دون انخفاض كبير في صلاحية الخلية. وستكون البروتوكولات مفيدة للدراسات التي تتطلب إعداد خلايا معزولة من ألسنة الفئران في مراحل النمو المبكر (E12.5) والشباب البالغين (8 أسابيع) التي تتطلب انفصال الخلايا عن مقصورات الأنسجة المختلفة.
Introduction
لسان الثدييات هو جهاز معقد حاسم للذوق ، والتحدث ، وتجهيز الأغذية. وهي تتألف من أنواع متعددة من الأنسجة عالية التنظيم مجزأة من قبل mesenchyme / النسيج الضام وتغطيها ورقة الظهارية الطبقية التي تحتوي على الحليمة الذوق وبراعم الذوق. مجموعات الخلايا في كل من ظهارة اللسان والأنسجة mesenchyme / الضام غير متجانسة. لفهم وظائف وتوزيع نوع معين من الخلايا في اللسان بشكل أفضل، من الضروري إجراء دراسات باستخدام خلايا مفككة. على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة هو وسيلة قوية وعالية الإنتاجية للتنميط النسخي في الخلايا الفردية، والتي تم تصميمها لفهم transcriptome من الأنسجة المعقدة فيقرار خليةواحدة 1،2،3،4. وقد ثبت أن ثقافة الخلايا الأولية أداة مفيدة لدراسة وظيفة وتمايز الخلايا الجذعية / السلف لبراعم الذوق5،6. تتطلب هذه الدراسات كمية كبيرة من مجموعات الخلايا المعزولة عالية الجودة (على سبيل المثال، العدد الإجمالي الكافي للخلايا مع التركيز المناسب والقدرة العالية على البقاء).
وبالتالي ، هناك حاجة لعزل الخلايا عن مناطق مختلفة من الأنسجة اللغوية وفي مراحل النمو المختلفة. حاليا، لا يوجد بروتوكول مفصل متاح للانشقاق الخلية من ظهارة اللسان والأنسجة الكامنة mesenchyme / الضام. هنا، نبلغ عن طريقة محسنة لتفكيك الخلايا لإعداد الخلايا للتجارب التي تتطلب جودة عالية من الخلايا الحية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وثقافات الخلايا الجذعية الأولية. وجدنا أن اختيار العازلة الهضم الأنزيمي، pipetting لطيف، واختيار متوسط إعادة الإنفاق، والوقت الأمثل الطرد المركزي والسرعة حاسمة لتوليد هذه الكميات الكبيرة من الخلايا عالية الجودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن، لم يكن هناك بروتوكول مفصل متاح لتفكك الخلية من ظهارة اللسان والأنسجة الكامنة mesenchyme / الضام. يوفر بروتوكول فص الخلية الحالي هذا إجراء قابلا للاستنساخ لإنشاء تعليق خلية واحدة مع قدرة عالية على البقاء (>90٪) من أنسجة لسان الفأر، بما في ذلك الصفائح الظهارية والأنسجة الظهارية / الضامة ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة، رقم المنح R01DC012308 وR21DC018089 إلى HXL. ونشكر بريت مارشال (جامعة جورجيا، أثينا، الجمعية العامة) وإيغون رانجيني (10X علم الجينوم، بليزانتون، كاليفورنيا) للمساعدة التقنية والتشاور بشأن تفكك الخلية؛ إلى فرانسيسكا جيبسون بيرنلي (جامعة جورجيا، أثينا، الجمعية العامة) للتحرير باللغة الإنجليزية.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
