Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen
Summary
We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.
Abstract
Celdissociatie is een essentiële procedure geweest voor studies op het niveau van de individuele cel en/of op celpopulatieniveau (bv. RNA-sequencing met één cel en primaire celcultuur). Het leveren van levensvatbare, gezonde cellen in grote hoeveelheden is van cruciaal belang en de optimale omstandigheden om dit te doen zijn weefselafhankelijk. Celpopulaties in het tongepitheel en het onderliggende mesenchyme/bindweefsel zijn heterogeen en weefselstructuren variëren in verschillende regio’s en in verschillende ontwikkelingsstadia. We hebben protocollen getest voor het isoleren van cellen uit het epitheel van de muistong en mesenchym/bindweefsel in de vroege ontwikkelingsfasen [embryonale dag 12,5 (E12,5)] en jongvolwassenen (8 weken). Een schone scheiding tussen het epitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel was eenvoudig te bereiken. Het is echter van cruciaal belang om cellen verder te verwerken en te isoleren, levensvatbare gezonde cellen in grote hoeveelheden op te leveren en zorgvuldige selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, incubatietijd en centrifugeersnelheid en -tijd. Incubatie van gescheiden epitheel of onderliggend mesenchym/bindweefsel in 0,25% Trypsine-EDTA gedurende 30 min bij 37 °C, gevolgd door centrifugeren bij 200 x g gedurende 8 min resulteerde in een hoge opbrengst van cellen met een hoge levensvatbaarheidssnelheid (>90%) ongeacht de muisstadia en tonggebieden. Bovendien ontdekten we dat zowel gedissocieerde epitheel- als mesenchymale/bindweefselcellen van embryonale en volwassen tongen ten minste 3 uur in het celkweekmedium konden overleven zonder een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel. De protocollen zullen nuttig zijn voor studies die de voorbereiding vereisen van geïsoleerde cellen uit muistongs in vroege ontwikkelingsstadia (E12.5) en young adult (8 weken) die celdissociatie van verschillende weefselcompartimenten vereisen.
Introduction
De zoogdiertong is een complex orgaan dat cruciaal is voor smaak, spreken en voedselverwerking. Het bestaat uit meerdere soorten sterk georganiseerde weefsels gecompartimenteerd door mesenchym / bindweefsel en bedekt met een gelaagd epitheelblad met smaakpapillen en smaakpapillen. Celpopulaties in zowel tongepitheel als mesenchym/bindweefsel zijn heterogeen. Om de functies en verdeling van een bepaald type cellen in de tong beter te begrijpen, zijn studies met gedissocieerde cellen nodig. RNA-sequencing met één cel is bijvoorbeeld een krachtige en hoge doorvoermethode voor transcriptomische profilering in afzonderlijke cellen, die is ontworpen om het transcriptoom van complex weefsel te begrijpen bij een eencellige resolutie1,2,3,4. Het is bewezen dat primaire celkweek een nuttig hulpmiddel is om de functie en differentiatie van stam-/voorlopercellen voor smaakpapillen te bestuderen5,6. Deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige geïsoleerde celpopulaties (bv. voldoende totaal celaantal met de juiste concentratie en hoge levensvatbaarheid).
Er is dus behoefte aan het isoleren van cellen uit verschillende regio’s van de linguale weefsels en in verschillende ontwikkelingsstadia. Momenteel is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Hier rapporteren we een geoptimaliseerde celdissociatiemethode om cellen voor te bereiden op experimenten die een hoge kwaliteit van levende cellen vereisen, zoals voor RNA-sequencing met één cel en primaire stamcelculturen. We ontdekten dat selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, zachte pipetting, selectie van resuspensiemedium en optimale centrifugeertijd en snelheid cruciaal zijn om deze grote hoeveelheden hoogwaardige cellen te genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot op heden is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Dit huidige celdissociatieprotocol biedt een reproduceerbare procedure om een enkele celsuspensie te genereren met een hoge cel levensvatbaarheid (>90%) van tongweefsels van muizen, met inbegrip van epitheelbladen en mesenchyme/bindweefsels in zowel embryonale als postnatale stadia, ook al zijn geïsoleerde cellen van E12.5 en volwassen muizen verschillend in grootte. Geïsoleerd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health, subsidienummer R01DC012308 en R21DC018089 aan HXL. We danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) en Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) voor technische bijstand en overleg over de celdissociatie; aan Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) voor Engelse bewerking.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
