Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila
Summary
Presentiamo un protocollo per un saggio di alimentazione a due scelte per le mosche. Questo test di alimentazione è veloce e facile da eseguire ed è adatto non solo per la ricerca di laboratorio su piccola scala, ma anche per schermi comportamentali ad alta produttività nelle mosche.
Abstract
Per selezionare alimenti con valore nutrizionale evitando il consumo di agenti nocivi, gli animali hanno bisogno di un sistema di gusto sofisticato e robusto per valutare il loro ambiente alimentare. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un organismo modello geneticamente trattabile che è ampiamente utilizzato per decifrare le basi molecolari, cellulari e neurali della preferenza alimentare. Per analizzare le preferenze del cibo a mosca, è necessario un metodo di alimentazione robusto. Descritto qui è un test di alimentazione a due scelte, rigoroso, economico e veloce. Il saggio è a base di piastra di Petri e prevede l’aggiunta di due diversi alimenti integrati con colorante blu o rosso alle due metà del piatto. Quindi, ~ 70 prestarved, mosche di 2-4 giorni vengono poste nel piatto e autorizzate a scegliere tra cibi blu e rossi al buio per circa 90 minuti. L’esame dell’addome di ogni mosca è seguito dal calcolo dell’indice di preferenza. A differenza delle piastre multiwell, ogni piastra di Petri impiega solo ~ 20 s per riempire e consente di risparmiare tempo e fatica. Questo saggio di alimentazione può essere impiegato per determinare rapidamente se alle mosche piace o non piace un particolare cibo.
Introduction
Nonostante le drammatiche differenze nella struttura anatomica degli organi del gusto tra mosche e mammiferi, le risposte comportamentali delle mosche a molte sostanze tastant sono sorprendentemente simili a quelle dei mammiferi. Ad esempio, le mosche preferisconolo zucchero 1,2,3,4,5,6,7,8, aminoacidi9,10e sale basso11, che indicano nutrienti, ma rifiutano cibi amari12,13,14,15 che sono sgradevoli o tossici. Negli ultimi due decenni, le mosche si sono dimostrate un organismo modello altamente prezioso per far progredire la comprensione di molte questioni fondamentali relative alla sensazione di gusto e al consumo di cibo, tra cui il rilevamento del tastant, la trasduzione del gusto, la plasticità del gusto e la regolazione dell’alimentazione16,17,18,19,20. Sorprendentemente, una serie di studi hanno dimostrato che i meccanismi di trasduzione del gusto e del circuito neurale alla base della percezione del gusto sono analoghi tra moscerini della frutta e mammiferi. Pertanto, la mosca della frutta funge da organismo sperimentale ideale, consentendo ai ricercatori di scoprire concetti e principi evolutivamente conservati che governano il rilevamento e il consumo di cibo nel regno animale.
Per indagare la sensazione di gusto nelle mosche, è fondamentale stabilire un saggio veloce e rigoroso per misurare oggettivamente la preferenza alimentare. Nel corso degli anni, vari metodi di alimentazione, come i test a base di colorante11,12,13,21,22,23, il saggio di risposta all’estensione della proboscide di mosca24,il test Di alimentazione capillare (CAFE)25, 25,26, il test Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)27e altri metodi combinatori sono stati sviluppati per misurare quantitativamente la preferenza alimentare e / o l’assunzione di cibo per imoscerini della frutta 28,29,30,31. Uno dei paradigmi di alimentazione popolari è il saggio di alimentazione a due scelte a base di colorante utilizzando una piastra di microtitoro multiwell12,21,32 o, come descritto qui, una piccola piastra di Petri11,22 come camera di alimentazione. Questo saggio è progettato in base alla trasparenza dell’addome della mosca. Durante questo saggio, le mosche vengono poste nella camera di alimentazione e presentate con due opzioni di cibo mescolate con colorante rosso o colorante blu. Una volta completato il test, gli addome di mosca appaiono rossi o blu a seconda del cibo che hanno consumato.
Sia la piastra di Petri che i test di alimentazione a base di colorante multiwell-plate sono altamente robusti e producono approssimativamente gli stessi risultati. Utilizzando questi due saggi, sono state fatte numerose importanti scoperte e scoperte verso la decifrazione dei recettori e delle cellule altamente diversificati responsabili del rilevamento dei gusti alimentari e della consistenza delcibo 11,12,21,22,32,33. Nel saggio a base di colorante, una fase sperimentale che richiede molto tempo e sforzi è la preparazione e il caricamento del cibo nella camera di alimentazione. Per ridurre il tempo di preparazione e caricamento degli alimenti, questo saggio è stato modificato sostituendo la piastra del microtitolo multiwell con una piccola piastra di Petri, che è divisa in due compartimenti uguali. Nel saggio a base di piastra di Petri, due diversi alimenti integrati con colorante blu o rosso vengono aggiunti alle due metà del piatto. Quindi, ~ 70 prestarved, mosche di 2-4 giorni vengono poste nel piatto e autorizzate a scegliere tra cibi blu e rossi al buio per circa 90 minuti. Viene quindi esaminato l’addome di ogni mosca e viene calcolato l’indice di preferenza (PI).
Questo test di alimentazione a due scelte basato su piastre di Petri è conveniente, semplice e veloce. Un piatto multiwell richiede circa 110 s per riempire, mentre ogni piastra di Petri richiede solo ~ 20 s. Inoltre, la piastra multiwell richiede la pipettazione di piccoli volumi di cibo in un gran numero di piccoli pozzi (ad esempio, 60 o più pozzi per piastra), il che richiede notevole precisione e attenzione. Al contrario, il saggio a base di piastra di Petri richiede solo due azioni per piatto. Poiché il saggio di alimentazione può coinvolgere un gran numero di repliche, il saggio a base di piastra di Petri consente di risparmiare una quantità non contributiva di tempo e fatica. Questo saggio dà risultati equivalenti a quelli del saggio multiwell-based e si è dimostrato efficace nell’affrontare molte domande fondamentali nella sensazione di gusto, tra cui la codifica del gusto delsale 11,la plasticità del gustomodificata dall’esperienza alimentare 22e la base molecolare della sensazione di consistenza delcibo 33. In sintesi, questo saggio a due scelte basato su piastra di Petri è un potente strumento per indagare come le mosche percepiscono l’ambiente nutritivo esterno e interno per suscitare un comportamento di alimentazione appropriato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo prevede diversi passaggi cruciali in cui possono verificarsi problemi. In primo luogo, assicurarsi che le mosche ingeriscono una quantità sufficiente di cibo per fornire dati stabili. Se le mosche mangiano male, assicurarsi che le mosche siano state bagnate per almeno 24 ore e che il supporto sperimentale contenga almeno una concentrazione minima di saccarosio (2 mM). Per stimolare ulteriormente il consumo di cibo, prolungare il periodo di fame umida oltre le 24 ore, a seconda delle condizioni fisiologiche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Tingwei Mi per averli aiutati a ottimizzare il test di alimentazione a due scelte. Vorrebbero anche ringraziare Samuel Chan e Wyatt Koolmees per i loro commenti sul manoscritto. Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) e R01 DC018592 (Y.V.Z.) e dalla Ambrose Monell Foundation.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
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