מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה
Summary
אנחנו מציגים פרוטוקול לבדיקת האכלה של שתי אפשרויות לזבובים. מבחני האכלה אלה מהירים וקלים להפעלה ומתאימים לא רק למחקר מעבדה בקנה מידה קטן, אלא גם למסכים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה בזבובים.
Abstract
כדי לבחור מזון בעל ערך תזונתי תוך הימנעות מצריכת חומרים מזיקים, בעלי חיים זקוקים למערכת טעם מתוחכמת וחזקה כדי להעריך את סביבת המזון שלהם. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, הוא אורגניזם מודל המתוח גנטית המשמש באופן נרחב לפענוח היסודות המולקולריים, התאיים והנוירונים של העדפת מזון. כדי לנתח העדפת מזון זבוב, יש צורך בשיטת האכלה חזקה. המתואר כאן הוא שתי אפשרויות האכלה, שהוא קפדני, חסכוני, ומהיר. ההסתעפות מבוססת פטרי-צלחת וכוללת תוספת של שני מזונות שונים בתוספת צבע כחול או אדום לשני חצאי המנה. לאחר מכן, ~ 70 prestarved, זבובים 2-4 יום מונחים בצלחת מותר לבחור בין מאכלים כחולים ואדומים בחושך במשך כ 90 דקות. בחינת הבטן של כל זבוב מלווה בחישוב מדד ההעדפות. בניגוד לצלחות multiwell, כל צלחת פטרי לוקח רק ~ 20 s כדי למלא וחוסך זמן ומאמץ. זה מבחני האכלה ניתן להעסיק כדי לקבוע במהירות אם זבובים כמו או לא אוהב מזון מסוים.
Introduction
למרות הבדלים דרמטיים במבנה האנטומי של איברי הטעם בין זבובים ליונקים, התגובות ההתנהגותיות של הזבובים לחומרים טעימים רבים דומות להפליא לאלה של היונקים. לדוגמה, זבובים מעדיפים סוכר1,2,3,4,5,6,7,8, חומצות אמינו9,10, ומלח נמוך11, אשר מצביעים על חומרים מזינים, אבל לדחות מזונות מרים12,13,14,15 כי הם unpalatable או רעיל. במהלך שני העשורים האחרונים, זבובים הוכיחו להיות אורגניזם מודל בעל ערך רב לקידום ההבנה של שאלות בסיסיות רבות הקשורות תחושת טעם וצריכת מזון, כולל גילוי טעים, התמרת טעם, פלסטיות טעם, תקנת האכלה16,17,18,19,20. למרבה הפלא, מספר מחקרים הראו כי מנגנוני התמרת הטעם והמעגל העצבי שבבסיס תפיסת הטעם מקבילים בין זבובי פירות ליונקים. לכן, זבוב הפירות משמש כאורגניזם ניסיוני אידיאלי, המאפשר לחוקרים לחשוף מושגים ועקרונות שמורים מבחינה אבולוציונית השולטים בזיהוי וצריכת מזון בממלכת החי.
כדי לחקור את תחושת הטעם בזבובים, חיוני להקים מבחנה מהירה וקפדנית למדידת העדפת מזון באופן אובייקטיבי. במהלך השנים, שיטות האכלה שונות, כגון מבחנים מבוססי צבע11,12,13,21,22,23, תגובת הארכת פרובוסיס זבוב24, מאכיל נימי (CAFE) assay25,26, מונה האינטראקציה של Fly Liquid-Food (FLIC) assay27, ושיטות קומבינטוריות אחרות פותחו כדי למדוד כמותית העדפת מזון ו / או צריכת מזון עבור זבובי פירות28,29,30,31. אחת מפרדיגמות ההאכלה הפופולריות היא מבחני האכלה דו-ברירה המבוססים על צבע באמצעות צלחת מיקרוטיטר רב-ערוצית12,21,32 או, כמתואר כאן, צלחת פטרי קטנה11,22 כתא האכלה. בדיקה זו מתוכננת על בסיס שקיפות הבטן של הזבוב. במהלך חקירה זו, זבובים ממוקמים לתוך תא ההאכלה ומוצגים עם שתי אפשרויות מזון מעורבב עם צבע אדום או צבע כחול. לאחר השלמת ההסמכה, הבטן לעוף מופיעים אדום או כחול תלוי איזה מזון הם צורכים.
הן צלחת פטרי והן מבחני האכלה מבוססי צבע רב-תכליתי הם חזקים מאוד ומניבים בערך את אותן תוצאות. באמצעות שתי מבחנים אלה, תגליות חשובות רבות פריצות דרך נעשו לקראת פענוח קולטנים מגוונים מאוד תאים האחראים על חישת טעמי מזון ומרקם מזון11,12,21,22,32,33. במהלך ההסמכה המבוססת על צבע, צעד ניסיוני אחד הדורש זמן ומאמץ ניכרים הוא הכנה והעמסה של מזון לתא ההזנה. כדי להפחית את זמן הכנת המזון והטעינה, מבחנה זו שונתה על ידי החלפת צלחת microtiter multiwell עם צלחת פטרי קטנה, אשר מחולק לשני תאים שווים. ב בדיקה המבוססת על צלחת פטרי, שני מזונות שונים בתוספת צבע כחול או אדום מתווספים שני חצאים של המנה. לאחר מכן, ~ 70 prestarved, זבובים 2-4 יום מונחים בצלחת מותר לבחור בין מאכלים כחולים ואדומים בחושך במשך כ 90 דקות. הבטן של כל זבוב נבדקת לאחר מכן, ומדד ההעדפות (PI) מחושב.
מבחני האכלה דו-ברירה המבוססים על פטרי הם זולים, פשוטים ומהירים. צלחת אחת multiwell דורש כ 110 s כדי למלא, ואילו כל צלחת פטרי לוקח רק ~ 20 s. בנוסף, צלחת multiwell דורש צינור כמויות קטנות של מזון לתוך מספר גדול של בארות קטנות (למשל, 60 או יותר בארות לכל צלחת), אשר דורש דיוק ניכר ותשומת לב. לעומת זאת, ההסתעפות המבוססת על צלחת פטרי דורשת רק שתי פעולות לכל צלחת. כמו מבחני האכלה יכול לכלול מספר רב של עותקים משוכפלים, Assay מבוסס צלחת פטרי חוסך כמות לא טריוויאלית של זמן ומאמץ. בדיקה זו נותנת תוצאות שוות ערך לאלה של הבדיקה מבוססת multiwell והוכיחה מוצלחת בהתמודדות עם שאלות בסיסיות רבות בתחושת הטעם, כולל קידוד טעם מלח11, פלסטיות טעם שונה על ידי ניסיון מזון22, ואת הבסיס המולקולרי של תחושת מרקם מזון33. לסיכום, זה פטרי-צלחת מבוסס שתי אפשרויות assay הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור כיצד זבובים לתפוס milieus מים מזינים חיצוניים ופנימיים כדי לעורר התנהגות האכלה מתאימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו כוללת מספר שלבים מכריעים שבהם עלולות להתרחש בעיות. ראשית, ודאו שזבובים בולעים כמות מספקת של מזון כדי לספק נתונים יציבים. אם זבובים אוכלים בצורה גרועה, ודאו שהזבובים מורעבים במשך 24 שעות לפחות, ושהמדיה הניסיונית מכילה לפחות ריכוז סוכרוז מינימלי (2 מ”מ). כדי להמריץ עוד יותר את צריכת המז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר טינגווי מי שעזר להם לייעל את מבחני ההאכלה של שתי הנבחרות. הם גם רוצים להודות לסמואל צ’אן וויאט קולמס על הערותיהם על כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R03 DC014787 (Y.V.Z.) ו R01 DC018592 (Y.V.Z.) ועל ידי קרן אמברוז מונל.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
- Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
- Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
- Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
- Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
- Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
- Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
- Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
- Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
- Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
