Cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse

Het cerebellum bevat meer dan de helft van de neuronen in de hersenen en is historisch aangeduid als een motorische controle en evenwicht centrum in de hersenen¹. Meer recentelijk hebben studies aangetoond dat het cerebellum een sleutelrol speelt in verschillende andere functies, waaronder cognitie, beloningsverwerking en^2,3,4,5beïnvloedt .

Het cerebellum heeft een goed beschreven anatomie: het cortexgebied bestaat uit korrels, Purkinje en moleculaire lagen. Korrelcellen vormen de korrelcellaag en sturen via parallelle vezels input naar de Purkinje-celdendrieten van de moleculaire laag die ook input ontvangen van klimvezels die afkomstig zijn van de inferieure olijf. Purkinje-cellen sturen remmende projecties naar cellen in de diepe cerebellaire kernen (DCN), die dient als de belangrijkste output van het cerebellum. De output van dit cerebellaire circuit wordt verder gemoduleerd door de activiteit van de remmende interneurons in de cerebellaire cortex, waaronder Golgi, stellaat en mandcellen⁴. Deze cerebellaire functionele eenheid is verdeeld over alle lobules van de cerebellaire cortex. Ondanks deze relatief uniforme circuits over het cerebellum wijst bewijs uit menselijke neuroimaging literatuur en patiëntenstudies op functionele heterogeniteit van het cerebellum^6,7.

De cerebellaire cortex kan worden onderverdeeld in twee hoofdgebieden: de middellijngedefinieerde vermis en de laterale hemisferen. De vermis kan verder worden onderverdeeld in voorste en achterste lobules. Deze verschillende gebieden van het cerebellum zijn betrokken bij het bijdragen aan verschillende gedragingen. Taak-opgeroepen of taakvrije activiteitspatronen impliceerden dat voorste gebieden van de vermis meer bijdragen aan de motorische functie, terwijl posterieure vermis meer bijdraagt aan cognitie^6,7. De vermis is ook verbonden met affect en emoties, terwijl cerebellaire hemisferen bijdragen aan uitvoerende, visueel-ruimtelijke, taal en andere mnemonische functies⁸. Bovendien leverden anatomische studies bewijs dat functioneel verschillende cerebellaire regio’s verbonden zijn met verschillende corticale regio’s⁹. Laesiesymptomen in kaart gebracht bleek dat patiënten met beroertes die de voorste lobules aantasten (die zich uitstrekken tot lobule VI) slechtere prestaties hadden bij fijne motorische taken, terwijl patiënten met schade aan achterste kwabregio’s en hemisferen cognitieve tekorten vertoonden bij afwezigheid van cerebellair motorisch syndroom¹⁰. Ten slotte geeft regionale cerebellaire pathologie bij ziekten aan dat functioneel verschillende cerebellaire regio’s ook verschillend vatbaar zijn voor ziekte^11,12.

Hoewel veel minder onderzocht, toont voorlopig bewijs verschillende genexpressiesignaturen aan in cerebellaire corticale regio’s. Purkinje celexpressie van Zebrin II toont regiospecifieke patronen in de vermis zodanig dat er meer Zebrin II positieve cellen in de achterste lobules en minder in de voorste lobules¹³. Dit correleert ook met regionaal onderscheidende fysiologische functie als Zebrin II negatieve Purkinje cellen vertonen een hogere frequentie van tonic vuren dan Purkinje cellen die Zebrin II positief¹⁴.

Naast de cerebellaire cortex omvat het cerebellum de diepe cerebellaire kernen (DCN) die dienen als de primaire output voor het cerebellum. De kernen bestaan uit de mediale (MN), interposed (IN) en laterale kernen (LN). Functionele beeldvorming en patiëntstudies hebben aangetoond dat de DCN ook deelneemt aan verschillende gedragingen¹⁵, maar zeer weinig studies onderzoeken genexpressieverandering in DCN.

Vooruitgang in moleculaire technieken heeft het mogelijk gemaakt om regionale genexpressie in de hersenen te beoordelen en heeft heterogeniteit in en binnen verschillende hersengebieden in zowel fysiologische als ziektetoestanden blootgelegd¹⁶. Dergelijke studies impliceren dat het cerebellum verschilt van andere hersengebieden. De verhouding van neuronen tot gliacellen wordt bijvoorbeeld omgekeerd in het cerebellum in vergelijking met andere hersengebieden¹. Zelfs in normale fysiologische omstandigheden wordt de expressie van pro-inflammatoire genen geüreguleerd in het cerebellum in vergelijking met de andere hersengebieden¹⁷. Moleculaire technieken zijn ook zeer nuttig geweest bij het identificeren van de paden die bijdragen aan de pathogenese van cerebellaire ziekten. Bijvoorbeeld, RNA sequencing van de hele cerebellaire extracten geïdentificeerd genen veranderd in een Purkinje cel specifieke transgene muis model van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) in vergelijking met hun wild type controles. Dergelijk bewijs heeft belangrijke moleculaire routes onthuld die ten grondslag liggen aan pathogenese in cerebellaire Purkinje-cellen en heeft geholpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen¹⁸. Recente studies suggereren echter dat er verschillen zijn in de kwetsbaarheid voor ziekten in de cerebellaire regio ‘s^11,12,19. Dit kan erop wijzen dat er belangrijke veranderingen optreden in verschillende cerebellaire regio’s, die kunnen worden gemaskeerd of onopgemerkt met hele cerebellaire extracten. Er is dus behoefte aan technieken waarmee onderzoekers moleculaire profielen in verschillende cerebellaire gebieden kunnen onderzoeken.

De hier voorgestelde techniek beschrijft een reproduceerbare methode om vier verschillende gebieden van het muis cerebellum te ontleden om RNA van die gebieden te isoleren en regionale verschillen in genexpressie te onderzoeken. Het schema van het muis cerebellum in figuur 1A markeert de vermis in blauw en hemisferen in geel. In het bijzonder maakt deze techniek het mogelijk om vier regio’s te isoleren: diepe cerebellaire kernen (DCN) (roodgestippelde vakken in figuur 1A),de cerebellaire cortex van voorste vermis (CCaV) (donkerblauw in figuur 1A),de cerebellaire cortex van de posterieure vermis (CCpV) (lichtblauw in figuur 1A)en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH) (geel in figuur 1A). Door de genexpressie van deze regio’s afzonderlijk te beoordelen, zal het mogelijk zijn om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan discrete functies van deze verschillende regio’s, evenals potentiële verschillen in hun kwetsbaarheid voor ziekten.