Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro¹. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto^2,3,4,5.

O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grânulo e enviam entrada através de fibras paralelas aos dendritos celulares Purkinje da camada molecular que também recebem entrada de fibras de escalada que se originaram na azeitona inferior. As células purkinje enviam projeções inibitórias para as células nos núcleos cerebelares profundos (DCN), que serve como a principal saída do cerebelo. A saída deste circuito cerebelar é ainda mais modulada pela atividade dos interneurônios inibitórios no córtex cerebelar, incluindo Golgi, stellate e células cesta⁴. Esta unidade funcional cerebelar é distribuída por todos os lobules do córtex cerebelar. Apesar deste circuito relativamente uniforme em todo o cerebelo, evidências da literatura de neuroimagem humana e estudos de pacientes indicam heterogeneidade funcional do cerebelo^6,7.

O córtex cerebelar pode ser dividido em duas regiões principais: os vermis definidos pela linha média e os hemisférios laterais. Os vermis podem ser ainda divididos em lobulos anteriores e posteriores. Essas regiões distintas do cerebelo foram implicadas em contribuir para diferentes comportamentos. Padrões de atividade evocados por tarefas ou sem tarefas implicaram que as regiões anteriores dos vermis contribuem mais para a função motora, enquanto vermis posteriores contribuem mais para a cognição^6,7. Os vermis também estão ligados ao afeto e às emoções, enquanto os hemisférios cerebelares contribuem para funções executivas, visuais-espaciais, linguísticas e outras funções mnemônicas⁸. Além disso, estudos anatômicos forneceram evidências de que regiões cerebelares funcionalmente distintas estão conectadas com diferentes regiões corticais⁹. O mapeamento de lesões-sintomas revelou que pacientes com derrames que afetam os lobulos anteriores (estendendo-se ao lobule VI) apresentaram pior desempenho em tarefas motoras finas, enquanto pacientes com danos em regiões posteriores do lobo e hemisférios apresentaram déficits cognitivos na ausência da síndrome motor cerebelar¹⁰. Por fim, a patologia cerebelar regional em doença indica que as regiões cerebelares funcionalmente distintas também são diferentemente suscetíveis à doença^11,12.

Embora muito menos exploradas, evidências preliminares demonstram distintas assinaturas de expressão genética em regiões corticais cerebelares. A expressão celular purkinje de Zebrin II mostra a padronização específica da região nos vermímis de tal forma que há mais células positivas zebrin II nos lobulos posteriores e menos nos lobulos anteriores¹³. Isso também se correlaciona com a função fisiológica regionalmente distinta, pois as células Purkinje negativas zebrin II apresentam maior frequência de disparo tônico do que as células Purkinje que são Zebrin II positiva¹⁴.

Além do córtex cerebelar, o cerebelo inclui os núcleos cerebelares profundos (DCN) que servem como a saída primária para o cerebelo. Os núcleos são compostos pelos núcleos medial (MN), interposto (IN) e núcleos laterais (LN). Imagens funcionais e estudos de pacientes demonstraram que o DCN também participa de vários comportamentos¹⁵, mas pouquíssimos estudos examinam a mudança da expressão genética no DCN.

Os avanços nas técnicas moleculares permitiram avaliar a expressão genética regional no cérebro e descobriram a heterogeneidade em diferentes regiões cerebrais nos estados fisiológicos e de^{doenças 16}. Tais estudos implicam que o cerebelo é diferente de outras regiões cerebrais. Por exemplo, a proporção de neurônios para células gliais é invertida no cerebelo em comparação com outras regiões cerebrais¹. Mesmo em condições fisiológicas normais, a expressão de genes proinflamatórios é regulada no cerebelo em comparação com as outras regiões cerebrais¹⁷. Técnicas moleculares também têm sido muito úteis na identificação dos caminhos que contribuem para a patogênese das doenças cerebelares. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de todos os extratos cerebelares identificou genes alterados em um modelo de rato transgênico específico da célula Purkinje de ataxia spinocerebellar tipo 1 (SCA1) em comparação com seus controles de tipo selvagem. Tais evidências revelaram as principais vias moleculares subjacentes à patogênese nas células cerebelares Purkinje e ajudaram a identificar potenciais alvos terapêuticos¹⁸. No entanto, estudos recentes sugerem que há diferenças na vulnerabilidade às doenças nas regiões cerebelares^11,12,19. Isso pode indicar que há mudanças-chave ocorrendo em regiões cerebelares distintas, que podem ser mascaradas ou não detectadas com extratos cerebelares inteiros. Assim, é necessário desenvolver técnicas que permitam aos pesquisadores examinar perfis moleculares em diferentes regiões cerebelares.

A técnica aqui proposta descreve um método reprodutível para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo, a fim de isolar o RNA dessas regiões e explorar diferenças regionais na expressão genética. O esquema do cerebelo do rato na Figura 1A destaca os vermísis em azul, e hemisférios em amarelo. Especificamente, esta técnica permite isolar quatro regiões: núcleos cerebelares profundos (DCN) (caixas pontilhadas vermelhas na Figura 1A), o córtex cerebelar de vermis anterior (CCaV) (azul escuro em Figura 1A), o córtex cerebelar dos vermis posteriores (CCpV) (azul claro na Figura 1A), e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH) (amarelo na Figura 1A). Ao avaliar a expressão genética dessas regiões separadamente, será possível investigar mecanismos moleculares subjacentes a funções discretas dessas diferentes regiões, bem como potenciais diferenças em sua vulnerabilidade na doença.