Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа

Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге^1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние^2,3,4,5.

Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные дендриты Пуркинье молекулярного слоя, которые также получают входные данные от вьющихся волокон, возникших в нижней оливе. Клетки Пуркинье посылают ингибирующие проекции клеткам в глубоких мозжечковых ядрах (DCN), которые служат основным выходом из мозжечка. Выход этого мозжечкового контура дополнительно модулируется активностью ингибирующих интернейронов в коре мозжечка, включая гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки^4. Этот мозжечковой функциональный блок распределен по всем долочкам коры мозжечка. Несмотря на эту относительно однородную схему по всему мозжечку, данные из литературы по нейровизуализации человека и исследований пациентов указывают на функциональную гетерогенность мозжечка^6,7.

Кору мозжечка можно разделить на две основные области: среднюю, определенную вермисом, и боковые полушария. Вермис можно далее разделить на переднюю и заднюю дольки. Эти различные области мозжечка были причастны к содействию различному поведению. Паттерны активности, вызванные задачами или без задач, связаны с тем, что передние области вермиса вносят больший вклад в двигательную функцию, в то время как задние вермисы вносят больший вклад в познание^6,7. Вермис также связан с аффектами и эмоциями, в то время как полушария мозжечка способствуют исполнительным, визуально-пространственным, языковым и другим мнемоническим функциям^8. Кроме того, анатомические исследования предоставили доказательства того, что функционально различные мозжечковые области связаны с различными областями коры^9. Картирование симптомов поражения показало, что пациенты с инсультами, затрагивающими передние дольки (распространяющиеся в дольку VI), имели более низкую производительность при выполнении мелкомоторных задач, в то время как пациенты с повреждением областей задней доли и полушарий демонстрировали когнитивный дефицит при отсутствии мозжечкового моторного синдрома^10. Наконец, регионарная мозжечковая патология при заболевании указывает на то, что функционально различные мозжечковые области также по-разному восприимчивы к заболеванию^11,12.

Хотя предварительные данные гораздо менее изучены, они демонстрируют различные сигнатуры экспрессии генов в мозжечковых корковых областях. Экспрессия клеток Пуркинье Зебрина II показывает специфическую для области структуру в вермисе, так что в задних дочках больше положительных клеток Зебрина II и меньше в передних долеках^13. Это также коррелирует с регионально отличной физиологической функцией, поскольку отрицательные клетки Зебрина II Пуркинье демонстрируют более высокую частоту тонического возбуждения, чем клетки Пуркинье, которые являются положительными Зебрином II^14.

В дополнение к коре мозжечка, мозжечок включает глубокие мозжечковые ядра (DCN), которые служат основным выходом для мозжечка. Ядра состоят из медиал (MN), интерпозиции (IN) и боковых ядер (LN). Функциональная визуализация и исследования пациентов продемонстрировали, что DCN также участвует в различных поведенческих действиях^15,но очень немногие исследования изучают изменение экспрессии генов в DCN.

Достижения в области молекулярных методов позволили оценить региональную экспрессию генов в мозге и выявили гетерогенность между и внутри различных областей мозга как в физиологическом, так и в заболевании состояний^16. Такие исследования показывают, что мозжечок отличается от других областей мозга. Например, отношение нейронов к глиальным клеткам инвертируется в мозжечке по сравнению с другими областями мозга^1. Даже в нормальных физиологических условиях экспрессия провоспалительных генов повышается в мозжечке по сравнению с другими областями мозга^17. Молекулярные методы также были очень полезны для выявления путей, которые способствуют патогенезу мозжечковых заболеваний. Например, секвенирование РНК всех экстрактов мозжечка идентифицировало гены, измененные в специфической для клетки Пуркинье трансгенной мышиной модели спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1) по сравнению с их контролем дикого типа. Такие данные выявили ключевые молекулярные пути, лежащие в основе патогенеза в мозжечковых клетках Пуркинье, и помогли идентифицировать потенциальные терапевтические мишени^18. Однако последние исследования показывают, что существуют различия в уязвимости к заболеваниям в мозжечковых областях^11,12,19. Это может указывать на то, что существуют ключевые изменения, происходящие в различных мозжечковых областях, которые могут быть замаскированы или незамечены целыми экстрактами мозжечка. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, которые позволят исследователям изучать молекулярные профили в различных мозжечковых областях.

Предлагаемый здесь метод описывает воспроизводимый метод рассечения четырех различных областей мозжечка мыши, чтобы изолировать РНК из этих областей и исследовать региональные различия в экспрессии генов. Схема мозжечка мыши на рисунке 1А выделяет вермис синим цветом, а полушария желтым. В частности, этот метод позволяет выделить четыре области: глубокие ядра мозжечка (DCN) (красные пунктирные коробки на рисунке 1A),мозжечковая кора передней вермисы (CCaV) (темно-синий на рисунке 1A),мозжечковая кора задней вермисы (CCpV) (светло-синяя на рисунке 1A)и мозжечковая кора полушарий (CCH) (желтый на рисунке 1A). Оценивая экспрессию генов этих областей отдельно, можно будет исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дискретных функций этих различных областей, а также потенциальные различия в их уязвимости при заболевании.