Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse

Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet¹. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung und^{Affekt 2,3,4,5}.

Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilden die Granulatzellschicht und senden den Input über parallele Fasern an die Purkinje-Zelldendriten der Molekülschicht, die auch Input von Kletterfasern erhalten, die aus der unteren Olive stammen. Purkinje-Zellen senden hemmende Projektionen an Zellen in den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), die als Hauptausgang des Kleinhirns dienen. Die Ausgabe dieses Kleinhirnkreislaufs wird durch die Aktivität der inhibitorischen Interneuronen in der Kleinhirnrinde, einschließlich Golgi-, Stern- und Korbzellen, weiter moduliert⁴. Diese kleinhirnförmige Funktionseinheit ist über alle Läppchen der Kleinhirnrinde verteilt. Trotz dieser relativ einheitlichen Schaltkreise über das Kleinhirn deuten Beweise aus der Human-Neuroimaging-Literatur und Patientenstudien auf eine funktionelle Heterogenität des Kleinhirns^{hin 6,7}.

Die Kleinhirnrinde kann in zwei Hauptregionen unterteilt werden: die mittelliniendefinierte Vermis und die laterale Hemisphäre. Die Vermis kann weiter in vordere und hintere Läppchen unterteilt werden. Diese unterschiedlichen Regionen des Kleinhirns wurden in die Lage verwickelt, zu unterschiedlichen Verhaltensweisen beizutragen. Aufgaben-evozierte oder aufgabenfreie Aktivitätsmuster implizieren, dass vordere Regionen der Vermis mehr zur motorischen Funktion beitragen, während hintere Vermis mehr zur Kognition beitragen^6,7. Die Vermis ist auch mit Affekt und Emotionen verbunden, während Kleinhirnhemisphären zu exekutiven, visuell-räumlichen, sprachlichen und anderen mnemonischen Funktionen beitragen⁸. Darüber hinaus lieferten anatomische Studien Hinweise darauf, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen mit verschiedenen kortikalen Regionen verbunden sind⁹. Die Kartierung der Läsionssymptome ergab, dass Patienten mit Schlaganfällen, die die vorderen Läppchen betrafen (bis in das Läppchen VI hinein), eine schlechtere Leistung bei feinmotorischen Aufgaben zeigten, während Patienten mit Schäden an den hinteren Lappenregionen und Hemisphären kognitive Defizite in Abwesenheit des kleinhirnmotorischen Syndroms^{aufwiesen 10}. Schließlich zeigt die regionale Kleinhirnpathologie bei Krankheiten, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen auch unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind^11,12.

Obwohl viel weniger erforscht, zeigen vorläufige Beweise unterschiedliche Genexpressionssignaturen über zerebelläre kortikale Regionen hinweg. Die Purkinje-Zellexpression von Zebrin II zeigt eine regionsspezifische Musterung in der Vermis, so dass es mehr Zebrin II-positive Zellen in den hinteren Läppchen und weniger in den vorderen Läppchen gibt¹³. Dies korreliert auch mit einer regional unterschiedlichen physiologischen Funktion, da Zebrin II-negative Purkinje-Zellen eine höhere Frequenz des tonischen Feuerns aufweisen als Purkinje-Zellen, die Zebrin II-positiv sind¹⁴.

Neben der Kleinhirnrinde umfasst das Kleinhirn die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die als Primärausgang für das Kleinhirn dienen. Die Kerne bestehen aus den medialen (MN), interposierten (IN) und lateralen Kernen (LN). Funktionelle Bildgebung und Patientenstudien haben gezeigt, dass das DCN auch an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt ist¹⁵, aber nur sehr wenige Studien untersuchen die Veränderung der Genexpression in DCN.

Fortschritte in molekularen Techniken haben es ermöglicht, die regionale Genexpression im Gehirn zu beurteilen und haben Heterogenität zwischen und innerhalb verschiedener Gehirnregionen sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen aufgedeckt¹⁶. Solche Studien implizieren, dass sich das Kleinhirn von anderen Gehirnregionen unterscheidet. Zum Beispiel ist das Verhältnis von Neuronen zu Gliazellen im Kleinhirn im Vergleich zu anderen Hirnregionen invertiert¹. Selbst unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Expression von proinflammatorischen Genen im Kleinhirn im Vergleich zu den anderen Hirnregionen hochreguliert¹⁷. Molekulare Techniken waren auch sehr nützlich bei der Identifizierung der Wege, die zur Pathogenese von Kleinhirnerkrankungen beitragen. Zum Beispiel identifizierte die RNA-Sequenzierung der gesamten Kleinhirnextrakte Gene, die in einem Purkinje-zellspezifischen transgenen Mausmodell der spinozerebellären Ataxie Typ 1 (SCA1) im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen verändert wurden. Solche Beweise haben wichtige molekulare Wege aufgedeckt, die der Pathogenese in kleinhirnen Purkinje-Zellen zugrunde liegen, und haben dazu beigetragen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren¹⁸. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es Unterschiede in der Anfälligkeit für Krankheiten in den Kleinhirnregionen gibt^11,12,19. Dies könnte darauf hindeuten, dass es in verschiedenen Kleinhirnregionen zu wichtigen Veränderungen kommt, die mit ganzen Kleinhirnextrakten maskiert oder unentdeckt sein können. Daher müssen Techniken entwickelt werden, die es Forschern ermöglichen, molekulare Profile in verschiedenen Kleinhirnregionen zu untersuchen.

Die hier vorgeschlagene Technik beschreibt eine reproduzierbare Methode, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren, um RNA aus diesen Regionen zu isolieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Das Schema des Kleinhirns der Maus in Abbildung 1A hebt die Vermis in Blau und die Hemisphären in Gelb hervor. Insbesondere ermöglicht diese Technik die Isolierung von vier Regionen: tiefe Kleinhirnkerne (DCN) (rot gepunktete Kästchen in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis (CCaV) (dunkelblau in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis (CCpV) (hellblau in Abbildung 1A)und die Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH) (gelb in Abbildung 1A). Durch die getrennte Beurteilung der Genexpression dieser Regionen wird es möglich sein, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den diskreten Funktionen dieser verschiedenen Regionen zugrunde liegen, sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.