JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61760
, , , , , ,
1School of Geography Earth and Environmental Sciences,University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics,Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry,Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة والبروتينات والأيضات ، التي تم الحصول عليها بواسطة المواد النانوية من السوائل الحيوية باستخدام الكهروفلوريس الشعري – نهج قياس الطيف الكتلي.

Abstract

كان امتصاص الجزيئات الحيوية من المصفوفات البيولوجية المحيطة إلى سطح المواد النانوية (NMs) لتشكيل الهالة موضع اهتمام على مدى العقد الماضي. ينشأ الاهتمام بالواجهة الحيوية النانوية من حقيقة أن الهالة الجزيئية الحيوية تمنح هوية بيولوجية ل NMs وبالتالي تجعل الجسم يحددها على أنها “ذاتية”. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الموجودة في الهالة قادرة على التفاعل مع مستقبلات الأغشية للتأثير على امتصاص الخلايا وأثبتت أن الهالة مسؤولة عن الاتجار الخلوي بالأجهزة NMs وسمية ها في نهاية المطاف. حتى الآن، ركزت معظم الأبحاث على هالة البروتين وتجاهلت الآثار المحتملة للمييضات المدرجة في الهالة أو الآثار التآزرية بين المكونات في الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة. على هذا النحو، يوضح هذا العمل منهجيات لتوصيف كل من مكونات البروتين وال المستقلب من الهالة الجزيئية الحيوية باستخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى ونواتج الأيض بالتوازي. وهذا يشمل هضم على الجسيمات من هالة البروتين مع السطحي المستخدمة لزيادة استعادة البروتين, وتوصيف سلبي للهالة المستقلب من خلال تحليل المصفوفات المستقلب قبل وبعد التعرض NM. يقدم هذا العمل الكهروفورسيس الشعري – قياس الطيف الكتلي (CESI-MS) كتقنية جديدة لتوصيف هالة NM. وتبين البروتوكولات المبينة هنا كيف يمكن استخدام CESI-MS لتوصيف موثوق به لكل من البروتين والهالة المستقلب التي حصلت عليها NMs. الانتقال إلى CESI-MS يقلل بشكل كبير من حجم العينة المطلوبة (مقارنة بالكروماتوغرافيا السائلة التقليدية – نهج قياس الطيف الكتلي (LC-MS) مع حقن متعددة ممكنة من أقل من 5 ميكرولتر من العينة ، مما يجعلها مثالية للعينات المحدودة الحجم. وعلاوة على ذلك، فإن العواقب البيئية للتحليل تنخفض فيما يتعلق بالتصلب المتعدد LC بسبب انخفاض معدلات التدفق (<20 nL/min) في CESI-MS، واستخدام الشوارد المائية التي تلغي الحاجة إلى المذيبات العضوية.

Introduction

التفاعلات الحيوية نانو، في واجهة بين الأسطح نانوماتي (NM) والمصفوفات البيولوجية التي من الجزيئات الحيوية الممتز إلى NM، هو مجال مكثف للبحوث التي تقوم عليها السلامة النانوية والطب النانوي1. هذه الطبقة من الجزيئات الحيوية الممتزة تمنح هوية بيولوجية ل NMs ، وبالتالي تحددها الخلايا بأنها “ذاتية” ، مما يؤثر لاحقا على امتصاص الخلايا وتوزيعها ونقاط النهاية البيولوجية2و3و4. وقد ركزت الغالبية العظمى من الدراسات الحيوية نانو على البروتينات داخل الهالة، وأظهرت أن البروتينات تختلف كميا ونوعيا بين NMs من مختلف التراكيب5. يعتمد هذا الاختلاف على خصائص NM مثل الحجم والوظيفية والمواد بالإضافة إلى خصائص المصفوفة البيولوجية بما في ذلك التركيب ومحتوى الملح5. وهناك مجال متزايد من الاهتمام في واجهة بيو نانو هي الأيض التي الممهرة إلى NMs6. وقد أظهرت العديد من الدراسات أنه، كما هو الحال مع البروتينات، خصائص NM هي عامل رئيسي في تحديد تكوين الأيض في الهالة وأنها يمكن أن تؤثر على النتائج البيولوجية للتعرض NM6،7،8.

في دراسات الهالة الجزيئية الحيوية هناك أربع مراحل متميزة لتوصيفها ، وتشكيل الهالة ، وعزل الجزيئات الحيوية داخل الهالة ، واكتشافها عن طريق قياس الطيف الكتلي النوعي أو الكمي وتحديد9. حتى الآن، وقد اعتمدت مجموعة من التقنيات لعزل هالة البروتين بما في ذلك الغليان في SDS-PAGE تشغيل العازلة، واستخراج المذيبات والملح أو الهضم المباشر للبروتينات في الموقع على سطح NMs. من حيث الأيض في الهالة ، والعزلة أكثر تعقيدا مع أساليب مختلفة باستخدام المذيبات أو حتى حل NMs المقترحة كحلول8،10،11. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، من غير المرجح أن ينطبق نهج “مقاس واحد يناسب الجميع” على عزل المستقلبات من NMs ، بسبب المساحة الكيميائية الواسعة التي يشغلها المستقلب وتنوع NMs المحتملة. وهناك نهج بديل هو توصيف المصفوفة البيولوجية قبل وبعد التعرض NM مع الفرق في تركيزات المستقلب يعزى إلى امتصاص الأيض إلى NMs.

هذا النهج البديل سيكون قابلا للتطبيق على جميع المركبات الحيوية وNMs وعلى الرغم من أنه لا يتطلب ضعف التحليل، فإنه يوفر بالتالي مقياسا أكثر دقة بكثير من هالة المستقلب وليس لديه خطر من انخفاض المستقلب يتعافى من سطح NM يجري مخطئا لربط منخفضة من المستقلب محددة.

الخطوة الثانية لتحليل الهالة الجزيئية الحيوية هي الكشف عن الجزيئات الحيوية. تقليديا للبروتينات في الهالة، وكان هذا اختصاص نانو LC-MS، العمود الفقري للبروتيوميات. كما تم تطبيق أساليب أخرى مثل NMR13و 1D و 2D SDS-PAGE. من حيث الهالة المستقلب LC-MS7, GC-MS8 وقد استخدمت قياس الطيف كتلة التسريب المباشر14. ومع ذلك ، بدأ نهج جديد في الآونة الأخيرة لكسب الجر ، وهي الكهروفلوريس الشعرية – قياس الطيف الكتلي (CE-MS)11،15 وكان موجودا في مختبرات NM كتقنية مستقلة لتوصيف مختلف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للNMs16. CE-MS هو تقنية فصل متعامدة لnanoLC-MS وGC-MS وقادر على تمكين الكشف عن الأيض القطبية للغايةوالمشحنة 17،18. وعلاوة على ذلك، CE-MS هو مناسبة تماما لتحليل البروتينات وتعديلاتها بعد النقل مثل الفوسفور والجليكوزيليشن19،20،21،22. ويمكن تنفيذ الخطوة النهائية وتحديد الهوية وتحليل البيانات بعدة طرق اعتمادا على ما إذا كان يتم استخدام نهج كمي / نوعي أو مستهدف / غير مستهدف ، ومع ذلك ، يقع هذا خارج نطاق هذا البروتوكول.

CESI-MS، وهو مزيج من CE وواجهة nanoESI، هو تقدم حديث في تكنولوجيا CE باستخدام واجهة غمد. وهذا يمكن الاتصال المباشر للتدفق المنخفض للغاية CE (<20 nL/min) بمطياف كتلة عالي الدقة بدون تخفيف ، مما يؤدي إلى تحسن كبير في حساسية الكشف23و24و25. CESI-MS تمكن حجم العينات محدودة (< 10 ميكرولتر) ليتم تحليلها مع الحفاظ على تحليل حساس للغاية26. CESI-MS يقارن أيضا بشكل إيجابي إلى معدل التدفق المنخفض التقليدية نانولك-MS النهج المستخدمة في البروتيوميات وeabolomics من حيث استنساخ27،28، والإنتاجية، وتحمل أكثر مما يجعلها احتمال مثيرة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية كاملة.

لتسليط الضوء على إمكانات CESI-MS لتحليل التفاعلات الحيوية نانو هذا العمل يصف إعداد العينة المطلوبة لعزل الهالة الجزيئية الحيوية NM من عينة البلازما البشرية واحدة بطريقة لتحقيق أقصى قدر من البيانات من كل من البروتين وجوانب المستقلب من هالة NM الجزيئية الحيوية الكاملة. بينما نحن تقرير عن استخدام البلازما البشرية، وهذا البروتوكول يكون مناسبا على قدم المساواة لالسوائل الحيوية الأخرى مثل مصل الدم، كامل الخلايا المتوسطة ثقافة، lysate الخلية، السائل النخاعي أو البول. ثم سيتم وصف تحليلات هذين المكونين (البروتينات والأيض) باستخدام الشعيرات الدموية المحايدة المغلفة CESI للهالة البروتين والشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة العارية لكل من الأيض القيصري والأيوني.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام السائل الحيوي البشري وفقا للمبادئ التوجيهية بروتوكول IRB من جامعة لايدن وجامعة إنسبروك الطبية. عندما يتم التحقيق في السوائل الحيوية البشرية أو الحيوانية ، مطلوب موافقة أخلاقية من مؤسسة البحث ، وقد تم الحصول عليها في حالة النتائج الموضحة في هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك ينبغي أيضا أن يتم إعداد تقارير كافية لضمان الشفافية وإعادة استخدام البيانات في العمل المستقبلي9و29و30. 1. إعداد الشوارد الخلفية (BGE) ملاحظة: يجب إعداد جميع المذيبات في غطاء الدخان المناسب ويجب استخدام معدات الحماية الشخصية الكافية لجميع الخطوات (معطف وقفازات ونظارات واقية). في كل خطوة، مطلوب قنينات بلاستيكية منخفضة الربط لتقليل فقدان التحليل وتلوث العينة بالأملاح المذابة من الأواني الزجاجية. إعداد 10٪ حمض الخليك BGE (v/v)، درجة الحموضة 2.2 على أساس يومي لنواتج الأيض. في قارورة حجمية 10 مل إضافة 1 مل من حمض الخليك، تليها إضافة المياه deionized (DI) إلى خط ملحوظ وخلط شامل. إعداد حمض الخليك 100 mM، درجة الحموضة 2.9 على أساس يومي لبروتيوميوم. في قارورة حجمية 10 مل إضافة 57 ميكرولتر من حمض الخليك، تليها إضافة المياه DI إلى خط ملحوظ وخلط شامل. 2. إعداد NM تفريق NMs بقوة في الماء باستخدام المبادئ التوجيهية المنشورة31،32،33.ملاحظة: في تطوير هذا البروتوكول، استخدمت 7 NMs على النحو التالي: 100 و 1000 نانومتر البوليسترين carboxylated استخدمت للبروتين والهالة المستقلب، على التوالي. 100 نانومتر غير معدلة البوليسترين NMs, 13 نانومتر anatase TiO2 NMs التي كانت غير معدلة أو المغلفة إما البولي أكريلات أو البوليمرات PVP و 22 نانومتر غير معدلة SiO2 NMs استخدمت لكل من البروتين والهالة المستقلب. في حين تم تطوير هذه الطريقة وأثبتت باستخدام هذه NMs، تجدر الإشارة إلى أن هذا النهج سيكون قابلا للتطبيق على مجموعة واسعة من التراكيب NM، والأحجام والأشكال، والمورفولوجيا. تميز حجم الجسيمات باستخدام إما ضوء ديناميكي تشتت34،35، جسيم واحد يقترن استحثاليا البلازما الطيف الكتل36، تحليل تتبع الجسيمات النانوية37، أو المجهر الإلكتروني انتقال وشحن السطح كما زيتا المحتملة باستخدام زيتا sizer34. 3. تشكيل الهالة الجزيئية الحيوية تقسيم 2 مل من البلازما البشرية (أو بيوفلويد من اختيار) إلى 1 مل aliquots, واحد لاليكوت المستقلب والبروتين كورونا والثانية لتوصيف الأيض البلازما. احتضان 1 ملغم / مل من NMs في البلازما البشرية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بينما الاختلاط بلطف في 500 دورة في الدقيقة في thermomixer. بعد حضانة الطرد المركزي العينة في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه NMs. جمع البلازما supernatant لتحليل الهالة المستقلب. الاحتفاظ مجمع كورونا NM-البروتين لتوصيف هالة البروتين. 4. عزلة هالة البروتين Resuspend NM-البروتين المعقدة (بيليه) في 1 مل من 10x برنامج تلفزيوني العازلة ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة. الطرد المركزي حل برنامج تلفزيوني في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه NMs، وإزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه. Resuspend بيليه في 1 مل من العازلة بيكربونات الأمونيوم (ABC) (100 mM، pH 8.0) ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة والأملاح غير المرغوب فيها. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لكريات NMs؛ إزالة وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة. تقليل الروابط البروتين كبريتيد عن طريق حل بيليه البروتين NM في 20 ميكرولتر من العازلة ABC (100 mM درجة الحموضة 8) التي تحتوي على 10 mM dithiotheritol. احتضان حل التخفيض لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية. لهضم البروتينات، إضافة 2 ميكروغرام من الدرجة تسلسل تريبسين إلى 20 ميكرولتر من ABC تحتوي على 0.1٪ السطحي. احتضان محلول الهضم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. ألكيلات العينة بإضافة 20 ميكرولتر من iodoacetamide في 55 mM في 100 mM ABC واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة 20 ميكرولتر من 0.1 م HCl إلى شق السطحي وترك لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إثراء وإزالة الببتيدات باستخدام C18 معبأة تلميح ماصة تحلية. الرطب تلميح مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 50٪ أسيتونيتريل 5 مرات، نظيفة مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 5 مرات، ورسم وعينة elute 10 مرات، عينة desalt عن طريق مسح 80 ميكرولتر 0.1 ٪ حمض الفورميك 5 مرات وealute العينة 2 مرات مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 70٪ acetonitrile في أنبوب PCR منخفضة الربط نظيفة. Lyophilize العينات وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل. 5. عزل هالة ميتابوليت تأخذ البلازما التحكم وsupernatant من حضانة البلازما NM من الخطوة 3.3 والحفاظ على الجليد أثناء إعداد العينة. خذ 50 ميكرولتر من كل منها إلى قنينات منفصلة وتمييع 1 من كل 10 مع ماء DI. خذ 50 ميكرولتر من كل عينة مخففة وانتقل إلى قوارير جديدة للخطوة 5.3. إضافة 200 ميكرولتر كلوروفورم، 250 ميكرولتر الميثانول و 350 ميكرولتر DI المياه وخليط دوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 20,800 × ز عند 4 درجات مئوية. خذ 500 ميكرولتر من الناسخ الفائق والفلتر من خلال فلتر طرد مركزي 3 kDa لمدة 2 ساعة عند 10000 × غرام عند 4 درجات مئوية. خذ 430 ميكرولتر من الترافلترات وجاف في سرعة فاك. ويمكن الآن تجميد العينات قبل تحليلها. 6. إعداد نظام CESI-MS38 ملاحظة: قبل تثبيت الشعيرات الدموية، تحقق من أن مدخل ومنفذ نهاية الشعيرات الدموية سليمة وأنه لا توجد أية الكسر مرئية في الشعيرات الدموية. تركيب الشعرية المغلفة محايدة لتحليل هالة البروتين39. ضع شعرية مغلفة محايدة جديدة (طول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إعداد الشعيرات الدموية CESI للتحليل بروتيوميك. قم بمسح الشعرية الفاصلة في الاتجاه الأمامي باستخدام 100 mM من HCl لمدة 5 دقائق عند 100 psi وتحقق من تكوين القطيرات في منفذ الشعرية. تدفق فصل الشعرية مع BGE في 100 psi لمدة 10 دقيقة ثم DI المياه في 100 psi لمدة 30 دقيقة (وهذا مطلوب فقط للشعيرات الدموية الجديدة). تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان شكل قطرات في نهاية منفذ كل من الشعيرات الدموية. تدفق الشعيرات الدموية فصل مع الماء DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M HCl، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. زوجين CESI إلى MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا38. تركيب الشعرية السيليكا تنصهر عارية لتوصيف هالة المستقلب38. ضع شعرية السيليكا العارية الجديدة (بطول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إعداد الشعيرات الدموية CESI لتحليل الأيض. تدفق الشعرية فصل في الاتجاه الأمامي باستخدام 100٪ MeOH في 50 psi لمدة 15 دقيقة والتحقق من تشكيل قطرة في منفذ الشعرية. تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان قطرات تشكل في منفذ كل من الشعيرات الدموية. تدفق الشعرية الفصل مع المياه DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M NaOH، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. الزوجين CESI إلى ESI-MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا. 38 7. CE-MS لتحليل هالة البروتين عينات ريسوسبند من الخطوة 4.8 في 20 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 50 mM درجة الحموضة 4.0. إجراء 5 psi 10 s حقن الهيدروديناميكية من العينة. فصل باستخدام الجهد فصل 30 كيلو فولت مع الانحدار الضغط التالي: 0-10 دقيقة في 1 psi، 10-35 دقيقة في 1.5 psi و 35-45 دقيقة في 5 psi باستخدام 100 mM، درجة الحموضة 2.9 حمض الخليك كما BGE. جمع الأطياف الشامل بين 250-2000 م / ض مع أعلى 10 بيانات تعتمد على اقتناء التجزئة. بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl لمدة 3 دقائق في 100 psi و 10 دقيقة 100 psi من BGE لفصل الشعرية و 3 دقائق في 100 psi للشعيرات الدموية السائلة موصل. 8. CESI-MS لتحليل هالة المستقلب ملاحظة: يجب تحليل كافة العينات مرتين، مرة في الوضع الإيجابي للكشف عن الكاتيونات ومرة واحدة في الوضع السلبي للكشف عن أنيونات. عينات البلازما التحكم تحتاج إلى تحليلها على الأقل 5 مرات. Resuspend NM المكشوفة وغير المكشوفة عينات البلازما من الخطوة 5.4 في 430 ميكرولتر من المياه DI ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.1 ميكرومتر. خذ 95 ميكرولتر من الفيلترات وأضف 5 ميكرولتر من المعايير الداخلية عند 200 ميكرومتر للكاتيونات (كبرفون L-methionine) و400 ميكرومتر للأيونات (2,2,4,4-D4-حمض الستريك) ودوامة بقوة. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل تحليل CESI-MS. حقن عينة هيدروديناميكالي لمدة 30 ق (كاتيون) و 40 ق (أنيونات) في 2 psi. المستقلبات منفصلة في 10٪ حمض الخليك مع الجهد فصل 30 كيلو فولت في الأمام (كاتيون) وعكس (أنيونات) واسطة. ويساعد وضع فصل عكسي مع 0.5 PSI الضغط إلى الأمام على الشعرية الفصل. تعيين مطياف الكتلة لجمع البيانات في إيجابية (كاتيون) أو سلبية (أنيونات) وضع على مدى كتلة 65-1000 م / ض. بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl، 0.1 M NaOH، DI المياه وBGE في 50 psi لمدة 2 دقيقة.

Representative Results

الطريقة الموصوفة هي الأولى التي تميز كل من البروتينات والأيض في هالة الجزيئية الحيوية NM باستخدام نفس عينة البلازما البشرية. هذه الطريقة قادرة على الكشف عن >200 البروتينات ونواتج الأيض >150، وبالتالي تمكين نظرة عامة أشمل من الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي يتعين تحديدها، مما يتيح تعزيز فهم المرفق الخلوي NMs، وامتصاص والآثار. استخدام CESI-MS لكلا البروتيوميات(الشكل 1)و metabolomics (الشكل 2) الفصل والكشف يظهر نوافذ فصل جيدة على كل من الشعيرات الدموية لكل نهج. هذه الطريقة قادرة على التمييز بين البروتينات في الهالة عبر مجموعة واسعة من التراكيب NMs، مما يدل على قابلية الأساليب للتطبيق على NMs عبر مجموعة واسعة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية(الجدول 1). ويمكن أيضا تمييز بصمات الأصابع الفريدة من هالة المستقلب باستخدام الفرع الأيضي لهذه المنهجية(الشكل 3). على الرغم من أن هذا النهج يستخدم نهجا سلبيا لتوصيف هالة الأيض NM أنها لا تزال قادرة على الكشف عن رؤى مثيرة للاهتمام في دور الأيض في الهالة الجزيئية الحيوية مثل الامتزاز التفاضلي للأيزومرات (الشكل 4). الشكل 1: تصوير كهربي مثالي لفصل كورونا البروتيني SiO2 باستخدام CESI-MS بعد هضم على الجسيمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: مثال على الكتروفيروغرامات الأيونية المستخرجة التي تم الحصول عليها من المركبات الذاتية في البلازما بواسطة CE-MS. المركبات المرقم هي على النحو التالي: 1. Ornithine; 2. ليسين؛ 3. أرجينين; 4. هيستيدين؛ 5. الكرياتين; 6. غليسين; 7. ألانين؛ 8. فالين؛ 9. إيسولوسين; 10. ليوستين; 11. سيرين; 12. ثريونين; 13. الهليون; 14. ميثيونين; 15. الجلوتامين; 16. حمض الغلوتاميك. 17. فينيل-D5-ألانين; 18- فينيل ألانين؛ 19. تيروزين; 20. برولين; 21- ميثيونين سلفون (معيار داخلي). نشرت تحت وصول مفتوح الإبداعية المشاع CC BY الترخيص واستنسخت من تشانغ وآخرون17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1: تحليل هالة البروتين عبر مجموعة من 6 NMs. خريطة الحرارة لفئات البروتين المحددة على السيليكا (SiO2)،تيتانيا (TiO2)،PVP توج تيتانيا (TiO2-PVP)، dispex توج تيتانيا (TiO2-Dispex)، البوليسترين وكاربوكسيلات البوليسترين NMs. النسب المئوية تشير إلى وفرة البروتينات نسبة إلى إجمالي محتوى البروتين على أساس أعلى 3 الببتيدات وفرة لكل بروتين. وبالنظر إلى الاختلافات التي لوحظت في وفرة النسبية من البروتينات في الهالات NM مختلفة، فمن الواضح أن هذا البروتوكول المقترح حساسة بما فيه الكفاية للتمييز بين هالة البروتين من مختلف NMs. الشكل المستنسخة من تحليل CESI-MS من هالة البروتين، نشرت تحت وصول مفتوح المشاع الإبداعي CC BY ترخيص11. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول. الشكل 3: تحليل مستهدف للمييضات cationic في هالة NM. الامتزاز من الكاتيونات إلى SiO2 و TiO2 NMs. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NMs في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض للبوليسترين NMs. تمثل مخططات المربع القيم الدنيا والقصه، والنطاقات الوسيطة والبينية. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة بموجب ترخيص Creative Commons CC BY15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحليل مستهدف من الأيض الانيوني في هالة NM مع التركيز على الامتزاز الإيزومر. يظهر الامتزاز من أنيونات لمجموعة من الأجهزة التيتانيومية اختلافات واضحة بين ايزوميرات مختلفة مثل فوسفات السكر. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NM في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض لSIO2 والمؤامرات NMs. البوليسترين مربع تمثل القيم الدنيا والقصى، ومتوسط ونطاقات بين الكوارتيل. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة تحت وصول مفتوح الإبداعية المشتركة CC BY ترخيص15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. أنوليت متوسط منطقة ذروة RSD متوسط وقت ترحيل RSD 1928 الببتيدات خلال اليوم (ن = 3) 15% 0.30% 27 كاتيون خلال اليوم (ن = 16) 5.80% 2.20% 27 cation بين اليوم (ن = 36) 8.60% 1.80% الجدول 2: استنساخ النسخ المتماثلة التقنية CESI-MS للببتيدات والأيض cationic. RSD: الانحراف المعياري النسبي، كمقياس للتكرار. إن إمكانية إعادة إنتاج CESI-MS من حيث مناطق الذروة وأوقات الهجرة جيدة جدا ، حيث يكون لدى جميع التحليلات متوسط RSD <15٪ وأوقات الهجرة <2.2٪. وتبين هذه النتائج درجة الثقة العالية التي يمكن أن تعزى إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام هذه التقنية وتؤكد أن الاختلافات المكتشفة ترجع إلى اختلافات حقيقية في تكوين العينة (الإثراء على ال NMs) بدلا من الاختلاف التحليلي. يتم إنشاء الجدول 2 من النتائج المعروضة سابقا11،15.

Discussion

هذه هي الطريقة الأولى المقترحة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي تتضمن البروتينات والأيض ، من نفس العينة ، باستخدام CESI-MS. القدرة على توصيف كل من البروتينات والأيض من نفس العينة سوف تزيد بشكل كبير من كمية البيانات التي تم جمعها من التعرض التجريبي واحد تمكين رؤى جديدة في عملية تشكيل الهالة وآثارها على سمية NMs وفعالية مثل الأدوية النانوية. وعلاوة على ذلك، CESI-MS هو منصة مثالية لتوصيف كل من فئتي الجزيئات الحيوية مع مجرد تغيير الشعيرات الدموية المطلوبة. للمضي قدما، فإن الأساليب الجديدة التي تم تطويرها ل CE غير المائية ستمكن من إجراء الدهون باستخدام CE-MS40 وبالتالي فمن الممكن الآن تحليل البروتينات والأيض والدهون باستخدام منصة واحدة. وسيتطلب النهج التقليدية الحالية منصتين مخصصتين للتصلب المتعدد LC، إحداهما للهالة البروتينية و واحدة للهالة المستقلب. وبالتالي، يمكن لهذا النهج جمع ضعف البيانات باستخدام منصة تحليلية واحدة.

هناك بعض المحاذير لهذا النهج لا سيما مع هالة المستقلب كما يقترح هذا البروتوكول قياس غير مباشر للهالة. على هذا النحو, قد تنشأ مشكلة عندما تكون مستويات المستقلب موجودة بتركيزات عالية بالنسبة إلى NMs والانخفاض اللاحق في تركيز المستقلب في المصفوفة صغير. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، فمن غير المرجح أن يتم تطوير نهج “مقاس واحد يناسب الجميع” لعزل هالة المستقلب بسبب وجود كيمياء سطحية فريدة من نوعها لكل NM. للمضي قدما فمن المرجح أن يتم تطوير نهج محددة NM لعزل هالة المستقلب والتحقق من صحتها ومع ذلك; وهذا ينطبق فقط على أن NM محددة. على الرغم من هذا، فإن CESI-MS لا تزال منصة مناسبة للغاية لتوصيف الأيض القطبي المشحون بغض النظر عن كيفية عزلها. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه إذا لم تتشكل الكريات أثناء خطوات الطرد المركزي المصممة لكريات ال NMs، فقد تكون هناك حاجة إلى قوة طرد مركزي أعلى؛ هذا هو الأكثر احتمالا أن يحدث مع NMs أقل كثافة. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يتم الالتزام بجميع خطوات التصفية في إطار البروتوكول بسبب التجويف الضيق للشعيرات الدموية التي يمكن أن تصبح محظورة بسهولة إذا لم يتم التخلص من أي جسيمات بشكل كاف من العينة.

في حين أن هالة البروتين كانت منطقة مكثفة من البحوث لعدد من السنوات القدرة على الجمع بين ذلك مع هالة المستقلب هو مجال جديد من الاهتمام للعلماء التحقيق في واجهة النانو الحيوي6،14. حتى الآن، ركزت غالبية هذه الدراسات على غير القطبية، جزء الدهون من الهالة المستقلب9،28. هذه الطريقة الحالية تمكن من توصيف الأيض القطبية للغاية والمحملة في الهالة التي تشمل الأيض الهامة المشاركة في استقلاب الطاقة, تحلل, وتوليف الحمض النووي. ونتيجة لذلك ، عندما يقترن سير العمل البروتيوميات ، وصف أكثر شمولية من الهالة الجزيئية الحيوية ممكن. وهذا يتيح تحليلا أكثر تعمقا للتفاعلات الحيوية النانوية للمضي قدما. تمكن هذه الطريقة من تعزيز الرؤى الميكانيكية في الغدد الصماء بوساطة المستقبلات عن طريق التفاعلات البروتينية والمستقلب مع مستقبلات الأغشية. وعلاوة على ذلك، يمكن استكشاف التفاعلات بين وداخل الهالة بين البروتينات والجزيئات الصغيرة؛ على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن البروتينات في الهالة تلعب دورا رئيسيا في تجنيد الأيض15. تجدر الإشارة إلى أن النتائج التمثيلية في الشكل 3 والشكل 4 هي القياس الكمي المطلق للمثيلات ، ومع ذلك ، فإن اتباع نهج غير مستهدف باستخدام تحليل البيانات متعدد المتغيرات لمقارنة جميع ميزات CE-MS في الضوابط مقارنة بالبلازما المكشوفة من شأنه أيضا توضيح ربط المستقلب. وهكذا، هناك مجال كبير للتحقيق في كيفية، والتي، الأيض والبروتينات تؤثر على تجنيد كل منهما في الهالات NM. قد تساعد هذه الدراسات الإضافية في تصميم الهالات لتحسين تسليم الأدوية النانوية أو الكشف عن المزيد من العقبات أمام تطورها مثل قمع العمل الصيدلاني بسبب انسداد الهالة الجزيئية الحيوية أو إخفاء وظائف الاستهداف.

CESI-MS مع معدلات تدفق مقياس النانو من حوالي 20 نانولتر / دقيقة والحد الأدنى من استخدام المذيبات العضوية يقدم تحسنا في أوراق الاعتماد الخضراء والاقتصادية على معيار LC-MS و nanoLC-MS من حيث استخدام المذيبات، والتحديات الرئيسية لدراسات الأيض والبروتيوميات، على التوالي. CESI-MS يقدم نتائج قابلة للاستنساخ للغاية لكل من وقت الهجرة ومنطقة الذروة التي تقارن بشكل إيجابي مع أساليب LC-MS المستندةإلى 11،15. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع نانولك-MS، ترحيل ليست قضية في CESI-MS. لذلك ، لا يلزم تنظيف النظام على نطاق واسع بين تحليلات العينات ، مما يحسن بشكل كبير من إنتاجية العينة11.

وباختصار، فإن سير العمل المقترح هو الأول الذي يفصل نهجا لتوصيف كل من البروتين ومكونات المستقلب للهالة الجزيئية الحيوية الكاملة للNMs. وهذا يفتح جانبا جديدا من التفاعلات الحيوية نانو، هالة المستقلب، وبالتالي تمكين جمع ضعف البيانات من نفس العينة، مما يتيح فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات في واجهة النانو الحيوي.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.J.C وJ.A.T و I.L تعترف بتمويل المفوضية الأوروبية من خلال مشروع أفق 2020 ACEnano (المنحة رقم H2020-NMBP-2016-720952). و.ز تعترف بتمويل الدكتوراه من مجلس المنح الدراسية في الصين (CSC، رقم 201507060011). 22- تعترف منظمة البحوث العلمية الهولندية بالدعم المالي المقدم من خطة منحة فيدي (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment – and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Capillary ElectrophoresisMass SpectrometryCESI-MSProtein CoronaMetabolite CoronaNanomaterialsHuman PlasmaProtein CharacterizationMetabolite CharacterizationTrypsin DigestionC18 DesaltingSample Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image