ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

人間のバイオ流体の使用は、ライデン大学とインスブルック医科大学からのIRBプロトコルガイドラインに従って承認されました.ヒトまたは動物の生物流体が調査される場合、研究機関からの倫理的承認が必要であり、本プロトコルに示された結果の場合に得られた。さらに、将来の作業9、29、30におけるデータの透明性と再利用性を確保するために、適切なレポートを実行する必要があります。 1. バックグラウンド電解質の調製(BGE) 注:すべての溶剤は、適切なヒュームフードで準備する必要があり、適切な個人用保護具は、すべてのステップ(ラボコート、手袋、ゴーグル)に使用する必要があります。各ステップでは、低結合プラスチックバイアルは、ガラス製品から浸出した塩でサンプルの検体損失と汚染を最小限に抑えるために必要とされます。 10%酢酸BGE(v/v)、pH 2.2を毎日メタボロミクス用に調製します。 10 mLの体積フラスコに酢酸1 mLを加え、続いて脱イオン(DI)水をマークされたラインに添加し、完全に混合します。 プロテオミクス用の100 mM酢酸、pH 2.9を毎日準備します。 10 mLの体積フラスコに酢酸57 μLを加え、続いてDI水を印のラインに加えて、完全に混合します。 2. NM製剤 公表されたガイドライン31、32、33を使用して、NMを水に激しく分散させる。注:このプロトコルの開発では、7つのNMが次のように使用されました:100および1,000 nmカルボキシレートポリスチレンは、それぞれタンパク質および代謝物コロナに使用されました。100 nm未修飾ポリスチレンNMs、ポリアクリレートまたはPVPポリマーのいずれかで未修飾またはコーティングされた13nmアナターゼTiO2 NMsおよび22nm未修飾SiO2 NMsをタンパク質および代謝物コロナの両方に使用した。この方法は、これらのNMを用いて開発および実証されたが、このアプローチは、NMの組成、サイズ、形状、および形態の広い配列に適用可能であろうことに留意すべきである。 動的光散乱34、35、単粒子誘導結合プラズマ質量分析36、ナノ粒子追跡解析37、またはゼータサイザー34を用いたゼータ電位としての透過電子顕微鏡および表面電荷のいずれかを使用して、粒子サイズを特徴付け。 3. 生体分子コロナ形成 2 mLのヒト血漿(または選択した生体液)を1 mLのアリコートに分割し、1つは代謝産物とタンパク質のコロナ用、もう1つは血漿メタボローム特性評価用に割り込みます。 サーモミキサーで500rpmで軽く混合しながら、37°Cで1時間、ヒトプラズマ中の1mg/mLのNMをインキュベートします。インキュベーション遠心分離機に続いて、4°Cで15分間4,000 x g でサンプルをペレット化し、NMsをペレット化します。 血漿上清を収集し、コロナの代謝物を分析します。タンパク質コロナ特性評価のためのNM-タンパク質コロナ複合体を保持します。 4. タンパク質コロナ分離 NM-タンパク質複合体(ペレット)を1mLの10x PBSバッファーに再懸濁し、渦を2分間激しく再懸濁させて、アンバウンドタンパク質を除去します。PBS溶液を4000xgで4°Cで15分間遠心し、NMsをペレット化し、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去する。 ペレットを1mLの炭酸水素アンボネート緩衝液(ABC)(100mM、pH 8.0)と渦を2分間激しく再懸濁し、結合していないタンパク質および望ましくない塩を除去する。4°Cで15分間4,000 x g で遠心分離機をNMsをペレットにする。上清を削除し、廃棄します。この手順を繰り返します。 10 mMジチオアシトールを含む20 μLのABCバッファー(100 mM pH 8)にNM-タンパク質ペレットを溶解することにより、タンパク質ジスルフィド結合を低減します。56°Cで30分間の還元液をインキュベートします。 タンパク質を消化するには、0.1%界面活性剤を含むABCの20 μLに2μgのシーケンシンググレードトリプシンを加えます。37°Cで16時間消化液をインキュベートする。 アルキル酸試料は、100mM ABCで55mMで20μLのヨウドアセトアミドを添加し、室温で20分間インキュベートする。 20 μLの0.1 M HClを加えて界面活性剤を切断し、室温で10分間放置します。 C18パック脱塩ピペットチップを用いてペプチドを濃縮・脱塩する。 80 μL 0.1%のギ酸50%の酢酸50%の酸でチップを湿らせ、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗浄し、サンプルを10回引き上げて溶出し、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗い流してサンプルを2回溶出します。 サンプルを凍結乾燥し、分析まで-20 °Cで保存します。 5. 代謝物コロナ分離 ステップ3.3からNMプラズマインキュベーションから制御プラズマと上清を取り出し、サンプル調製中に氷の上に保管してください。 それぞれ50μLを別々のバイアルに取り、DI水で10分の1を希釈します。希釈したサンプルを50μLずつ取り、ステップ5.3の新しいバイアルに移動します。 200 μL クロロホルム、250 μL メタノール、350 μL DI 水を加え、2分間の渦混合物を2分間激しく加えます。4°Cで20,800 x g で10分間の遠心分離機。 上清500μLを取り、4°Cで10,000 x g で2時間の3kDa遠心フィルターを通してフィルターを取ります。430 μLの超浸透液を取り、速度で乾かします。分析の前にサンプルを凍結できるようになりました。 6. CESI-MSシステムの作成38 注意:毛細血管の取り付け前に、毛細血管の入口と出口の端がそのままであり、毛細血管に目に見える破損がないことを確認してください。 タンパク質コロナ分析のための中性コーティング毛細管の設置39. メーカーのガイドラインに従って、新しいニュートラルコーティングされたキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)をCESI機器に取り込みます。 プロテオミクス解析のためのCESI毛細血管の調製 100 psiで5分間HClの100 mMを使用して分離キャピラリーを前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。BGEで100 psiで10分間の分離キャピラリーをフラッシュし、100 psiでDI水を30分間洗浄します(これは新しい毛細血管にのみ必要です)。 分離毛細血管と導電性キャピラリーの両方を90 psiでBGEで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口端に液滴が形成されるようにします。 90 psiでDI水で分離キャピラリーを10分間洗い流し、0.1 M HClで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを洗い流します。先に説明したナノスプレーソースとアダプタを使用して、CESIをMSに結合します。 代謝物コロナ特性評価のための裸の融合シリカ毛細管の設置38. 新しい裸のシリカキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)を製造者のガイドラインに従ってCESIの器械に入れる。 メタボロミクス分析のためのCESI毛細血管の調製 分離キャピラリーを50psiで100%MeOHで15分間使用して前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。分離毛細管と導電性キャピラリーの両方を90 psiで90 psiで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口で液滴が形成されるようにします。 90 psiで10分間DI水で分離キャピラリーを洗い流し、0.1 M NaOHで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを行います。先に説明したように、ナノスプレーソースとアダプタを使用してESI-MSにCESIを結合します。38 7. タンパク質コロナ分析用CE-MS 50 mM酢酸アンモニウム pH 4.0 のステップ 4.8 から 20 μL のサンプルを再中断します。 5 psi 10 s の流体力学的注入をサンプルの実施します。30 kV分離電圧を使用して、1 psiで0-10分、1.5 psiで10〜35分、100 mMを使用して5 psiで35-45分、BGEとしてpH 2.9酢酸を使用して分離します。 top-10 データ依存フラグメンテーション取得により、250 ~ 2000 m/z の質量スペクトルを収集します。 サンプル間、0.1 M HClを用いて0.1 M HClを3分間100 psiで、BGEの10分100 psiで分離キャピラリーを分離し、導電性液体毛細管の場合は100 psiで3分間リンスします。 8. 代謝物コロナ分析用 CESI-MS 注: すべてのサンプルは、陽イオン検出用に正のモードで 1 回、陰性モードで 1 回、陰性検出のために 2 回分析する必要があります。制御プラズマサンプルは、少なくとも5回分析する必要があります。 ステップ5.4から430μLのDI水と2分間の激しい渦中のNM露光および未露出したプラズマサンプルを再中断します。0.1 μmの膜フィルターを通してフィルター。 95 μLの濾液を取り、200 μMでイオン(L-メチオニンスルホン)、陰イオン(2,2,4,4-D4-クエン酸)と渦に対して400 μMの内部標準を5 μL加え、渦を活発に加えます。CESI-MS分析前の4°Cで4,000 x g の遠心分離機を10分間行います。 2 psiで30 s(カチオン)と40 s(陰イオン)のサンプル流体力学的に注入します。 10% 酢酸で代謝産物を分離し、分離電圧は 30 kV で前方(カチオン)、逆(陰イオン)モードで分離します。逆分離モードは分離毛細管の0.5 psi前方圧力で補助される。 質量分析計を設定して、質量範囲 65~1000 m/z で正(陽イオン)または負(陰イオン)モードでデータを収集します。サンプル間、0.1 M HCl、0.1 M NaOH、DI水、BGEを50 psiで2分間リンスします。