JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61760
, , , , , ,
1School of Geography Earth and Environmental Sciences,University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics,Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry,Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd

Summary

Hier presenteren we een protocol om de volledige biomoleculaire corona, eiwitten en metabolieten te karakteriseren, verkregen door nanomaterialen uit biofluïden met behulp van een capillaire elektroforese – massaspectrometriebenadering.

Abstract

De adsorptie van biomoleculen van omringende biologische matrices naar het oppervlak van nanomaterialen (NMs) om de corona te vormen, is de afgelopen tien jaar van belang geweest. Interesse in de bio-nano interface komt voort uit het feit dat de biomoleculaire corona een biologische identiteit verleent aan NMs en er dus voor zorgt dat het lichaam ze identificeert als “zelf”. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de eiwitten in de corona in staat zijn om te interageren met membraanreceptoren om de cellulaire opname te beïnvloeden en hebben vastgesteld dat de corona verantwoordelijk is voor cellulaire handel in NMs en hun uiteindelijke toxiciteit. Tot op heden heeft het meeste onderzoek zich gericht op het eiwit corona en de mogelijke effecten van de metabolieten in de corona of synergetische effecten tussen componenten in de volledige biomoleculaire corona over het hoofd gezien. Als zodanig toont dit werk methodologieën aan om zowel de eiwit- als metabolietcomponenten van de biomoleculaire corona te karakteriseren met behulp van bottom-up proteomics en metabolomics benaderingen parallel. Dit omvat een on-particle digest van het eiwit corona met een oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om het eiwitherstel te verhogen, en een passieve karakterisering van de metaboliet corona door metabolietmatrices voor en na NM-blootstellingen te analyseren. Dit werk introduceert capillaire elektroforese – massaspectrometrie (CESI-MS) als een nieuwe techniek voor NM corona karakterisering. De hier beschreven protocollen laten zien hoe CESI-MS kan worden gebruikt voor de betrouwbare karakterisering van zowel het eiwit als de metaboliet corona die door NMs zijn verworven. De overgang naar CESI-MS vermindert het vereiste volume van het monster aanzienlijk (in vergelijking met traditionele vloeistofchromatografie – massaspectrometrie (LC-MS) benaderingen) met meerdere injecties mogelijk vanaf slechts 5 μL monster, waardoor het ideaal is voor volumebeleenmonsters. Bovendien worden de milieugevolgen van de analyse verminderd ten opzichte van LC-MS als gevolg van de lage debieten (<20 nL/min) bij CESI-MS en het gebruik van waterige elektrolyten, waardoor organische oplosmiddelen niet meer nodig zijn.

Introduction

Bio-nano-interacties, op het raakvlak tussen nanomateriaal (NM) oppervlakken en biologische matrices waaruit biomoleculen adsorberen aan de NM, is een intens onderzoeksgebied dat ten grondslag ligt aan nanoveiligheid en nanogeneeskunde1. Deze laag geadsorbeerde biomoleculen verleent een biologische identiteit aan NMs, waardoor cellen ze identificeren als “zelf”, wat vervolgens de cellulaire opname, distributie en biologische eindpunten2,3,4beïnvloedt . De overgrote meerderheid van de bio-nano studies hebben zich gericht op de eiwitten in de corona, en hebben aangetoond dat eiwitten kwantitatief en kwalitatief variëren tussen NMs van verschillende samenstellingen5. Deze variatie is afhankelijk van zowel de eigenschappen van de NM zoals grootte, functionalisering en materiaal naast de eigenschappen van de biologische matrix inclusief samenstelling en zoutgehalte5. Een toenemend interessegebied in de bio-nano-interface zijn de metabolieten die adsorberen aan NMs6. Verschillende studies hebben aangetoond dat, net als bij de eiwitten, NM-eigenschappen een belangrijke factor zijn bij het bepalen van de samenstelling van de metabolieten in de corona en dat ze de biologische resultaten van NM-blootstelling6,7,8kunnen beïnvloeden .

In studies van de biomoleculaire corona zijn er vier verschillende fasen aan de karakterisering ervan, coronavorming, de isolatie van de biomoleculen binnen de corona, hun detectie via kwalitatieve of kwantitatieve massaspectrometrie en identificatie9. Tot op heden zijn verschillende technieken toegepast om het eiwit corona te isoleren, waaronder koken in SDS-PAGE lopende buffer-, oplosmiddel- en zoutextracties of directe vertering van eiwitten in situ op het oppervlak van NMs. Wat de metabolieten in de corona betreft , is de isolatie complexer met verschillende methoden met oplosmiddelen of zelfs de ontbinding van de NMs die worden voorgesteld als oplossingen8,10,11. In tegenstelling tot het eiwit corona is het echter onwaarschijnlijk dat een “one size fits all”-benadering van toepassing is op de isolatie van metabolieten van NMs, vanwege de grote chemische ruimte die wordt ingenomen door de metaboloom en de diversiteit van mogelijke NMs. Een alternatieve benadering is om de biologische matrix voor en na nm-blootstelling te karakteriseren met het verschil in metabolietconcentraties toegeschreven aan de adsorptie van metabolieten aan NMs.12

Deze alternatieve benadering zou van toepassing zijn op alle biofluïden en NMs en hoewel er twee keer zoveel analyse voor nodig is, biedt zij bijgevolg een veel nauwkeurigere meting van de corona van metabolieten en bestaat er geen risico dat lage metabolietherstel van het NM-oppervlak wordt verward met een lage binding van de specifieke metaboliet.

De tweede stap naar de biomoleculaire corona analyse is de detectie van de biomoleculen. Traditioneel voor de eiwitten in de corona is dit de taak van nano-LC-MS, het werkpaard van proteomica; andere benaderingen zoals NMR13,1D en 2D SDS-PAGE zijn ook toegepast. In termen van de metaboliet corona LC-MS7, GC-MS8 en directe infusie massaspectrometrie zijn gebruikt14. Een nieuwe aanpak is echter onlangs begonnen tractie te krijgen, namelijk capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS)11,15 en is aanwezig geweest in NM-laboratoria als een op zichzelf staande techniek om verschillende fysische en chemische eigenschappen van NMs16te karakteriseren . CE-MS is een orthogonale scheidingstechniek voor nanoLC-MS en GC-MS en is in staat de detectie van zeer polaire en geladen metabolieten17,18mogelijk te maken . Bovendien is CE-MS zeer geschikt voor de analyse van eiwitten en hun posttranslationele modificaties zoals fosforylering en glycosylatie19,20,21,22. De laatste stap, identificatie en data-analyse kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van of een kwantitatieve / kwalitatieve of gerichte / niet-gerichte aanpak wordt gebruikt, dit valt echter buiten de bevoegdheid van dit protocol.

CESI-MS, een combinatie van CE en een nanoESI-interface, is een recente vooruitgang in CE-technologie met behulp van een schedeloze interface. Dit maakt een directe aansluiting van ultralage debiet CE (<20 nL/min) op een massaspectrometer met hoge resolutie zonder verdunning mogelijk, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde detectiegevoeligheid23,24,25. CESI-MS maakt het mogelijk volumebeleenmonsters (< 10 μL) te analyseren met behoud van een zeer gevoelige analyse26. CESI-MS vergelijkt ook gunstig met traditionele nanoLC-MS-benaderingen met een laag debiet die worden gebruikt in proteomica en metabolomics in termen van reproduceerbaarheid27,28, doorvoer, en dragen over waardoor het een opwindend vooruitzicht is voor de volledige biomoleculaire coronakarakterisering.

Om het potentieel van CESI-MS voor de analyses van bio-nano-interacties te benadrukken, beschrijft dit werk het monsterpreparaat dat nodig is om de NM-biomoleculaire corona te isoleren van één menselijk plasmamonster op een zodanige manier dat de gegevens van zowel de eiwit- als metabolietaspecten van de volledige biomoleculaire NM-corona worden gemaximaliseerd. Hoewel we verslag uitbrengen over het gebruik van menselijk plasma, zou dit protocol even geschikt zijn voor andere biofluïden zoals bloedserum, volledig celkweekmedium, cellysaat, hersenvocht of urine. De analyses van deze twee componenten (eiwitten en metabolieten) zullen vervolgens worden beschreven met behulp van neutraal gecoate CESI-haarvaten voor het eiwit corona en kale gesmolten silicacapillairen voor zowel kationische als anionische metabolieten.

Protocol

Het gebruik van menselijk biofluïdum is goedgekeurd volgens de IRB-protocolrichtlijnen van de Universiteit Leiden en de Innsbruck Medical University. Wanneer menselijke of dierlijke biofluïden worden onderzocht, is ethische goedkeuring van de onderzoeksinstelling vereist en is verkregen in het geval van de resultaten in dit protocol. Voorts dient ook adequate rapportage te worden uitgevoerd om transparantie en herbruikbaarheid van gegevens in toekomstige werkzaamheden9,29,30te waarborgen . 1. Bereiding van achtergrondelektrolyten (BGE) OPMERKING: Alle oplosmiddelen moeten worden bereid in een geschikte zuurkast en er moeten voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt voor alle stappen (labcoat, handschoenen en veiligheidsbril). In elke stap zijn laagbindende plastic flacons nodig om analytverlies en verontreiniging van het monster met zouten uit glaswerk te minimaliseren. Bereid dagelijks 10% azijnzuur BGE (v/v), pH 2,2 voor metabolomics. Voeg in een maatkolf van 10 ml 1 ml azijnzuur toe, gevolgd door de toevoeging van gedeioneerd (DI) water aan de gemarkeerde lijn en een grondige menging. Bereid dagelijks 100 mM azijnzuur, pH 2,9 voor proteomica. Voeg in een maatkolf van 10 ml 57 μL azijnzuur toe, gevolgd door de toevoeging van DI-water aan de gemarkeerde lijn en een grondige menging. 2. NM-voorbereiding Verspreid NMs krachtig in water met behulp van gepubliceerde richtsnoeren31,32,33.OPMERKING: Bij de ontwikkeling van dit protocol werden 7 NMs als volgt gebruikt: 100 en 1.000 nm carboxylated polystyreen werden respectievelijk gebruikt voor eiwit en metaboliet corona. 100 nm ongewijzigde polystyreen NMs, 13 nm anatase TiO2 NMs die ongewijzigd waren of bedekt waren met polyacrylaat of PVP polymeren en 22 nm ongewijzigde SiO2 NMs werden gebruikt voor zowel eiwit- als metaboliet coronas. Hoewel de methode werd ontwikkeld en gedemonstreerd met behulp van deze NMs, moet worden opgemerkt dat deze aanpak van toepassing zou zijn op een breed scala aan NM-composities, -maten, -vormen en -morfologieën. Karakteriseer deeltjesgrootte met behulp van dynamische lichtverstrooiing34,35, enkel deeltje inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie36, nanodeeltjesvolganalyse37, of transmissie-elektronenmicroscopie en oppervlaktelading als zetapotentiaal met behulp van een zetagrootter34. 3. Biomoleculaire coronavorming Splits 2 ml menselijk plasma (of biofluïdum naar keuze) in 1 ml aliquots, één voor de metaboliet en eiwit corona en de tweede voor plasmametaboloomkarakterisering. Incubeer 1 mg/ml NMs in het menselijk plasma gedurende 1 uur bij 37 °C terwijl u voorzichtig mengt bij 500 tpm in een thermomixer. Na incubatie centrifugeert u het monster bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de NMs te pelleteren. Verzamel het plasmasupernatant voor metaboliet corona-analyse. Behoud het NM-eiwit corona complex voor eiwit corona karakterisering. 4. Eiwit corona isolatie Resuspendeer het NM-eiwitcomplex (de pellet) in 1 ml 10x PBS Buffer en vortex krachtig gedurende 2 minuten om ongebonden eiwitten te verwijderen. Centrifugeer de PBS-oplossing gedurende 15 minuten bij 4 °C op 4.000 x g om de NMs te pelleteren en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumbicarbonaatbuffer (ABC) (100 mM, pH 8.0) en vortex krachtig gedurende 2 minuten om ongebonden eiwitten en ongewenste zouten te verwijderen. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C om de NMs te pelleteren; verwijder en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap. Verminder eiwitdisulfidebindingen door de NM-eiwitkorrel op te lossen in 20 μL ABC-buffer (100 mM pH 8) met 10 mM dithiotheritol. Incubeer de reductieoplossing gedurende 30 min bij 56 °C. Om eiwitten te verteren, voegt u 2 μg sequencing grade Trypsin toe aan 20 μL ABC met 0,1% oppervlakteactieve stof. Incubeer de digestoplossing gedurende 16 uur bij 37 °C. Alkylaat het monster door toevoeging van 20 μL iodoacetamide bij 55 mM in 100 mM ABC en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 20 μL 0,1 M HCl toe om de oppervlakteactieve stof te splijten en laat 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Verrijk en ontsalt peptiden met behulp van een C18 verpakte ontsalting pipet tip. Bevochtig de punt met 80 μL 0,1% mierenzuur 50% acetonitril 5 keer, reinig met 80 μL 0,1% mierenzuur 5 keer, trek en elute monster 10 keer, ontsalt monster door 80 μL 0,1 % mierenzuur 5 keer door te spoelen en elute het monster 2 keer met 80 μL 0,1% Lyophiliseer de monsters en bewaar bij -20 °C tot analyse. 5. Metaboliet corona isolatie Neem het controleplasma en het supernatant uit de NM-plasma-incubatie uit stap 3.3 en blijf op ijs tijdens de monstervoorbereiding. Neem 50 μL van elk in afzonderlijke flacons en verdun 1 op 10 met DI-water. Neem 50 μL van elk verdund monster en ga naar nieuwe flacons voor stap 5.3. Voeg 200 μL chloroform, 250 μL methanol en 350 μL DI water en krachtig vortexmengsel toe gedurende 2 min. Centrifugeer gedurende 10 min bij 20.800 x g bij 4 °C. Neem 500 μL supernatant en filtreer gedurende 2 uur bij 10.000 x g bij 4 °C door een 3 kDa centrifugaalfilter. Neem 430 μL ultrafiltratie en droog in een speedvac. Monsters kunnen nu worden ingevroren voordat ze worden geanalyseerd. 6. Voorbereiding van CESI-MS-systeem38 OPMERKING: Controleer vóór de installatie van de haarvaten of het in- en uitlaatuiteinde van de haarvaten intact zijn en of er geen zichtbare breuken in het haarvat zijn. Installatie van een neutraal gecoate capillair voor eiwit corona-analyse39. Plaats een nieuw neutraal gecoat capillair (90 cm lengte met een inwendige diameter van 30 μm) in het CESI-instrument volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bereiding van CESI-haarvaten voor proteomische analyse. Spoel het scheidingscapillair in de voorwaartse richting met 100 mM HCl gedurende 5 minuten bij 100 psi en controleer op druppelvorming aan de uitlaat van het capillair. Spoel scheiding capillair met BGE op 100 psi gedurende 10 min en vervolgens DI water op 100 psi gedurende 30 min (dit is alleen nodig voor nieuwe haarvaten). Spoel zowel het scheidingscapillair als het geleidende haarvat gedurende 5 minuten met BGE op 90 psi en zorg ervoor dat er druppels ontstaan aan het uiteinde van beide haarvaten. Spoel de scheiding capillair met DI water op 90 psi gedurende 10 min, dan 50 psi voor 10 min met 0.1 M HCl, gevolgd door 90 psi voor 10 min met DI water en tenslotte BGE op 90 psi voor 10 min. Koppel CESI aan de MS met behulp van een nanospraybron en adapter zoals eerder beschreven38. Installatie van kale gesmolten silicacapillair voor metaboliet coronakarakterisering38. Plaats een nieuw kaal gesmolten silicacapillair (90 cm lengte met een inwendige diameter van 30 μm) in het CESI-instrument volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bereiding van CESI-haarvaten voor metabolomics-analyse. Spoel het scheidingscapillair in de voorwaartse richting met 100% MeOH op 50 psi gedurende 15 minuten en controleer op druppelvorming aan de uitlaat van het capillair. Spoel zowel het scheidingscapillair als het geleidende haarvat gedurende 5 minuten met BGE op 90 psi en zorg ervoor dat er druppels ontstaan aan de uitlaat van beide haarvaten. Spoel het scheidingscapillair met DI-water op 90 psi gedurende 10 minuten, vervolgens 50 psi gedurende 10 minuten met 0,1 M NaOH, gevolgd door 90 psi gedurende 10 minuten met DI-water en ten slotte BGE bij 90 psi gedurende 10 minuten. Koppel CESI aan de ESI-MS met behulp van een nanospraybron en adapter zoals eerder beschreven. 38 7. CE-MS voor eiwit corona analyse Resuspend monsters van stap 4.8 in 20 μL van 50 mM ammoniumacetaat pH 4.0. Voer 5 psi 10 s hydrodynamische injectie van monster uit. Scheid met een scheidingsspanning van 30 kV met de volgende drukgradiënt: 0-10 min bij 1 psi, 10-35 min bij 1,5 psi en 35-45 min bij 5 psi bij 100 mM, pH 2,9 azijnzuur als BGE. Verzamel massaspectra tussen 250-2000 m/z met top-10 data afhankelijke fragmentatie acquisitie. Spoel tussen de monsters capillair met 0,1 M HCl gedurende 3 minuten bij 100 psi en 10 min 100 psi BGE voor scheiding capillair en gedurende 3 min bij 100 psi voor het geleidende vloeibare capillair. 8. CESI-MS voor metaboliet corona analyse OPMERKING: Alle monsters moeten tweemaal worden geanalyseerd, eenmaal in de positieve modus voor de detectie van kationen en eenmaal in de negatieve modus voor de detectie van anionen. De controleplasmamonsters moeten minstens 5 keer worden geanalyseerd. Resuspend NM blootgestelde en onbelichte plasmamonsters van stap 5.4 in 430 μL DI-water en krachtig vortex gedurende 2 min. Filtreer door een membraanfilter van 0,1 μm. Neem 95 μL filtraat en voeg 5 μL interne normen toe bij 200 μM voor kationen (L-methioninesulfon) en 400 μM voor anionen (2,2,4,4-D4-citroenzuur) en vortex krachtig. Centrifugeer bij 4.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten voorafgaand aan cesi-MS-analyse. Injecteer het monster hydrodynamisch gedurende 30 s (kationen) en 40 s (anionen) bij 2 psi. Afzonderlijke metabolieten in 10% azijnzuur met een scheidingsspanning van 30 kV in voorwaartse (kationen) en omgekeerde (anionen) modus. Omgekeerde scheidingsmodus wordt ondersteund met 0,5 psi voorwaartse druk op het scheidingscapillair. Stel massaspectrometer in om gegevens te verzamelen in positieve (kationen) of negatieve (anionen) modus over het massabereik 65-1000 m/z. Spoel tussen de monsters capillair met 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI water en BGE met 50 psi gedurende 2 min.

Representative Results

De beschreven methode is de eerste die zowel de eiwitten als metabolieten in de NM biomoleculaire corona karakteriseert met behulp van hetzelfde menselijke plasmamonster. Deze methode is in staat om >200 eiwitten en >150 metabolieten te detecteren, waardoor het meest uitgebreide overzicht van de volledige biomoleculaire corona kan worden bepaald, waardoor een beter begrip van NMs cellulaire gehechtheid, opname en effecten mogelijk wordt. Het gebruik van CESI-MS voor zowel proteomica (figuur 1) als metabolomica (figuur 2) scheiding en detectie toont goede scheidingsvensters op beide haarvaten voor elke benadering. Deze methode is in staat om onderscheid te maken tussen de eiwitten in de corona in een breed scala van NMs-samenstellingen, waardoor de toepasbaarheid van de methoden op NMs in een breed scala van fysische en chemische kenmerken wordt aangetoond (Tabel 1). De unieke vingerafdrukken van de metaboliet corona kunnen ook worden onderscheiden met behulp van de metabolomische tak van deze methodologie (Figuur 3). Hoewel deze benadering een passieve benadering gebruikt om de NM-metaboliet corona te karakteriseren, is het nog steeds in staat om interessante inzichten te ontdekken in de rol van metabolieten in de biomoleculaire corona, zoals de differentiële adsorptie van isomeren (Figuur 4). Figuur 1: Voorbeeld elektroferogram van een SiO2 eiwit corona scheiding met behulp van CESI-MS na een on-particle digest. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Voorbeeld van geëxtraheerde ionenelektroferogrammen verkregen uit endogene verbindingen in plasma door CE-MS. De genummerde verbindingen zijn als volgt: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginine; 4. Histidine; 5. Creatine; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucine; 10. Leucine; 11. Serine; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Methionine; 15. Glutamine; 16. Glutaminezuur; 17. Fenyl-D5-alanine; 18. Fenylalanine; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Methioninesulfon (interne standaard). Gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie en gereproduceerd uit Zhang et al17. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Tabel 1: Analyse van eiwit corona over een array van 6 NMs. Hittekaart van eiwitklassen geïdentificeerd op silica (SiO2),titania (TiO2), PVP-afgedekte titania (TiO2-PVP), dispex capped titania (TiO2-Dispex), polystyreen en carboxylated polystyreen NMs. Percentages hebben betrekking op de overvloed van de eiwitten ten opzichte van het totale eiwitgehalte op basis van de top 3 peptiden overvloed voor elk eiwit. Gezien de verschillen waargenomen in de relatieve overvloed aan eiwitten in de verschillende NM-coronas, is het duidelijk dat dit voorgestelde protocol voldoende gevoelig is om onderscheid te maken tussen de eiwit corona van verschillende NMs. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS analyse van het eiwit corona, gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie11. Klik hier om deze tabel te downloaden. Figuur 3: Gerichte analyse van de kationische metabolieten in de NM corona. Adsorptie van kationen op SiO2 en TiO2 NMs. Rood verwijst naar de initiële concentratie van metabolieten, terwijl blauw verwijst naar de concentratie metabolieten na een incubatie van 1 uur met de NMs bij 37 °C. De verlaging van de metabolietconcentratie in de oplossing is het gevolg van adsorptie van metabolieten op het NM-oppervlak. Er werd geen significante adsorptie van metabolieten waargenomen voor de polystyreen NMs. Boxplots vertegenwoordigen de minimum- en maximumwaarden, mediaan- en interkwartielbereiken. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS gerichte analyse van de metaboliet corona gepubliceerd onder een open access Creative Commons CC BY licentie15. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Gerichte analyse van de anionische metabolieten in de NM corona met een focus op isomeer adsorptie. Adsorptie van anionen op een reeks titania NMs vertoont duidelijke verschillen tussen verschillende isomeren zoals de suikerfosfaten. Rood verwijst naar de initiële concentratie metabolieten, terwijl blauw verwijst naar de concentratie metabolieten na een incubatietijd van 1 uur met nm bij 37 °C. De verlaging van de metabolietconcentratie in oplossing is het gevolg van adsorptie van metabolieten op het NM-oppervlak. Er werd geen significante adsorptie van metabolieten waargenomen voor de SiO2 en de polystyreen NMs. Boxplots vertegenwoordigen de minimum- en maximumwaarden, mediaan- en interkwartielbereiken. Figuur gereproduceerd uit een CESI-MS gerichte analyse van de metaboliet corona gepubliceerd onder een open access Creative Common CC BY licentie15. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Analyt Gemiddeld RSD-piekgebied Gemiddelde RSD-migratietijd 1928 peptiden intraday (n=3) 15% 0.30% 27 kationen intra-dag (n=16) 5.80% 2.20% 27 kationen inter-dag (n=36) 8.60% 1.80% Tabel 2: Reproduceerbaarheid van technische replica’s van CESI-MS voor peptiden en kationische metabolieten. RSD: relatieve standaardafwijking, als maat voor reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van CESI-MS in termen van piekgebieden en migratietijden is zeer goed, met alle analyten met een gemiddelde RSD-<15% en migratietijden < 2,2%. Deze resultaten tonen de hoge mate van vertrouwen aan die kan worden toegeschreven aan de gegevens die met deze techniek worden verzameld en bevestigen dat de gedetecteerde variaties te wijten zijn aan echte verschillen in steekproefsamenstelling (verrijking op NMs) in plaats van analytische variatie. Tabel 2 wordt gegenereerd op basis van eerder gepresenteerde resultaten11,15.

Discussion

Dit is de eerste methode die wordt voorgesteld om de volledige biomoleculaire corona met eiwitten en metabolieten uit hetzelfde monster te karakteriseren met behulp van CESI-MS. Het vermogen om zowel de eiwitten als metabolieten uit hetzelfde monster te karakteriseren, zal de hoeveelheid gegevens die zijn verzameld uit één experimentele blootstelling aanzienlijk verhogen, waardoor nieuwe inzichten mogelijk worden in het proces van coronavorming en de effecten ervan op de toxiciteit en werkzaamheid van NMs als nanomedicijnen. Bovendien is CESI-MS een ideaal platform om beide klassen van biomoleculen te karakteriseren met slechts een verandering van capillair vereist. In de toekomst zullen nieuwe methoden die zijn ontwikkeld voor niet-waterige CE lipidomics kunnen uitvoeren met BEHULP VAN CE-MS40, dus het is nu mogelijk om eiwitten, metabolieten en lipiden te analyseren met behulp van één platform. De huidige conventionele benaderingen vereisen twee speciale LC-MS-platforms, één voor het eiwit corona en één voor de metaboliet corona. Deze aanpak kan dus twee keer zoveel gegevens verzamelen met behulp van één analytisch platform.

Er zijn enkele kanttekeningen bij deze aanpak, met name bij de metaboliet corona, omdat dit protocol een indirecte meting van de corona voorstelt. Als zodanig kan zich een probleem voordoen wanneer de metabolietniveaus aanwezig zijn in hoge concentraties ten opzichte van de NMs en de daaropvolgende daling van de metabolietconcentratie in de matrix klein is. In tegenstelling tot de eiwit corona is het echter onwaarschijnlijk dat een “one size fits all” benadering van het isoleren van de metaboliet corona zal worden ontwikkeld omdat elke NM unieke oppervlaktechemieën heeft. In de toekomst is het echter waarschijnlijker dat NM-specifieke benaderingen om de metaboliet corona te isoleren zullen worden ontwikkeld en gevalideerd; dit is alleen van toepassing op die specifieke NM. Desondanks zal de CESI-MS nog steeds een zeer geschikt platform zijn voor de karakterisering van de polaire geladen metabolieten, ongeacht hoe ze zijn geïsoleerd. Opmerkelijk is ook dat als er geen pellet ontstaat tijdens de centrifugeerstappen die zijn ontworpen om de NMs te pelleteren, een hogere centrifugaalkracht nodig kan zijn; dit zal waarschijnlijk gebeuren met minder dichte NMs. Het is ook van cruciaal belang dat alle filterstappen binnen het protocol worden nageleefd vanwege de smalle boring van de haarvaten, deze kunnen gemakkelijk worden geblokkeerd als er geen deeltjes voldoende uit het monster zijn verwijderd.

Hoewel het eiwit corona al een aantal jaren een intensief onderzoeksgebiedis,is het vermogen om dat te combineren met de metaboliet corona een nieuw interessegebied voor wetenschappers die de bio-nano-interface6,14onderzoeken . Tot op heden hebben de meeste van deze studies zich gericht op de niet-polaire, lipidefractie van de metaboliet corona9,28. Deze huidige methode maakt de karakterisering mogelijk van de sterk polaire en geladen metabolieten in de corona, waaronder belangrijke metabolieten die betrokken zijn bij energiemetabolisme, glycolyse en DNA-synthese. Hierdoor is, in combinatie met de proteomics workflow, een meer holistische karakterisering van de biomoleculaire corona mogelijk. Dit maakt een meer diepgaande analyse van bio-nano interacties mogelijk. Deze methode maakt verbeterde mechanistische inzichten mogelijk in receptorgemedieerde endocytose via eiwit- en metabolietinteracties met membraanreceptoren. Bovendien kunnen inter- en intra-corona-interacties tussen eiwitten en kleine moleculen worden onderzocht; zo is onlangs aangetoond dat de eiwitten in de corona een sleutelrol spelen bij de rekrutering van metabolieten15. Het is vermeldensgeschikt dat de representatieve resultaten in figuur 3 en figuur 4 absolute kwantificering van metabolieten zijn, maar een niet-gerichte benadering met behulp van multivariate gegevensanalyse om alle CE-MS-kenmerken in controles in vergelijking met blootgesteld plasma te vergelijken, zou ook de binding van metabolieten verduidelijken. Er is dus een aanzienlijke ruimte om te onderzoeken hoe en welke metabolieten en eiwitten hun respectieve rekrutering in NM-coronas beïnvloeden. Deze aanvullende studies kunnen helpen bij het ontwerpen van coronas om de levering van nanomedicijnen te optimaliseren of verdere obstakels voor hun ontwikkeling bloot te leggen, zoals het onderdrukken van farmaceutische actie vanwege de biomoleculaire corona-blokkering of maskeringstargeting-targetingfunctionaliteiten.

CESI-MS met zijn debieten op nanoschaal van ongeveer 20 nL/min en minimaal gebruik van organische oplosmiddelen biedt een verbetering van de groene en economische geloofsbrieven ten opzichte van standaard LC-MS en nanoLC-MS in termen van oplosmiddelgebruik, de belangrijkste uitdagingen voor respectievelijk metabolomics- en proteomicsstudies. CESI-MS biedt zeer reproduceerbare resultaten voor zowel migratietijd als piekgebied die gunstig zijn in vergelijking met lc-ms-gebaseerde methoden11,15. Bovendien is overdracht in vergelijking met nanoLC-MS geen probleem bij CESI-MS. Daarom is een uitgebreide systeemopruiming tussen monsteranalyses niet vereist, wat de monsterdoorvoer aanzienlijk verbetert11.

Samengevat is de voorgestelde workflow de eerste die een aanpak beschrijft om zowel de eiwit- als metabolietcomponenten van de volledige biomoleculaire corona van NMs te karakteriseren. Dit ontgrendelt een nieuw aspect van bio-nano-interacties, de metaboliet corona, waardoor het verzamelen van twee keer zoveel gegevens uit hetzelfde monster mogelijk is, waardoor een vollediger begrip van interacties op de bio-nano-interface mogelijk wordt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.J.C, J.A.T en I.L erkennen financiering van de Europese Commissie via Horizon 2020-project ACEnano (subsidienr. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkent promotiefinanciering van de China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R erkent de financiële ondersteuning van de Vidi-subsidieregeling van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment – and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Capillary ElectrophoresisMass SpectrometryCESI-MSProtein CoronaMetabolite CoronaNanomaterialsHuman PlasmaProtein CharacterizationMetabolite CharacterizationTrypsin DigestionC18 DesaltingSample Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image