JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61760
, , , , , ,
1School of Geography Earth and Environmental Sciences,University of Birmingham, 2Biomedical Microscale Analytics,Leiden University, 3Institute of Medical Biochemistry,Medical University of Innsbruck, 4AB Sciex UK Ltd

Summary

Burada, kılcal elektroforez kullanılarak biyokütlelerden nanomalzemeler tarafından elde edilen tam biyomoleküler korona, proteinler ve metabolitleri karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz – kütle spektrometresi yaklaşımı.

Abstract

Koronayı oluşturmak için biyomoleküllerin çevredeki biyolojik matrislerden nanomalzemelerin (NM) yüzeyine adsorpsiyonu son on yıldır ilgi görüyor. Biyo-nano arayüze olan ilgi, biyomoleküler koronanın NM’lere biyolojik bir kimlik vermesi ve böylece vücudun onları “benlik” olarak tanımlamasına neden olmasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, önceki çalışmalar, koronadaki proteinlerin hücresel alımı etkilemek için membran reseptörleriyle etkileşime girebildiğini göstermiştir ve koronanın NM’lerin hücresel kaçakçılığından ve nihai toksisitelerinden sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bugüne kadar, çoğu araştırma protein koronasına odaklandı ve koronaya dahil edilen metabolitlerin olası etkilerini veya tam biyomoleküler koronadaki bileşenler arasındaki sinerjik etkileri göz ardı etti. Bu nedenle, bu çalışma, biyomoleküler koronanın hem protein hem de metabolit bileşenlerini paralel olarak aşağıdan yukarıya proteomik ve metabolomik yaklaşımlar kullanarak karakterize etmek için metodolojileri göstermektedir. Bu, protein iyileşmesini artırmak için kullanılan bir yüzey aktif madde ile protein koronasının parçacık üzerinde sindirilmesini ve NM maruziyetlerinden önce ve sonra metabolit matrislerini analiz ederek metabolit koronanın pasif bir şekilde karakterizeini içerir. Bu çalışma, NM korona karakterizasyonu için yeni bir teknik olarak kılcal elektroforez – kütle spektrometresi (CESI-MS) tanıtmaktadır. Burada özetlenen protokoller, CESI-MS’in NM’ler tarafından elde edilen hem protein hem de metabolit koronanın güvenilir bir şekilde karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. CESI-MS’e taşınma, gerekli numune hacmini (geleneksel sıvı kromatografisine kıyasla – kütle spektrometresi (LC-MS) yaklaşımlarına kıyasla) 5 μL’ye kadar numuneden mümkün olan çoklu enjeksiyonlarla büyük ölçüde azaltır ve hacim sınırlı numuneler için idealdir. Ayrıca, CESI-MS’teki düşük akış hızları (<20 nL/dk) ve organik çözücü ihtiyacını ortadan kaldıran sulu elektrolit kullanımı nedeniyle analizin çevresel sonuçları LC-MS açısından azaltılmıştır.

Introduction

Biyo-nano etkileşimler, nanomalzeme (NM) yüzeyleri ile biyomoleküllerin adsorb’dan NM’ye kadar olduğu biyolojik matrisler arasındaki arayüzde, nanogüvenlik ve nanotıp1’idestekleyen yoğun bir araştırma alanıdır. Adsorbe edilmiş biyomoleküllerin bu katmanı NM’lere biyolojik bir kimlik verir, böylece hücreler onları “benlik” olarak tanımlar, daha sonra hücresel alım, dağılım ve biyolojik uç noktaları2,3,4‘ ü etkilemez. Biyo-nano çalışmaların büyük çoğunluğu korona içindeki proteinlere odaklanmıştır ve proteinlerin farklı bileşimlerdeki NM’ler arasında nicel ve niteliksel olarak değiştiğini göstermiştir5. Bu varyasyon, kompozisyon ve tuz içeriği de dahil olmak üzere biyolojik matrisin özelliklerine ek olarak boyut, işlevselleştirme ve malzeme gibi NM’nin özelliklerine bağlıdır5. Biyo-nano arayüzde yükselen bir ilgi alanı, NMs6’yaadsorb yapan metabolitlerdir. Çeşitli çalışmalar, proteinlerde olduğu gibi, NM özelliklerinin koronadaki metabolitlerin bileşimini belirlemede önemli bir faktör olduğunu ve NM maruziyetinin biyolojik sonuçlarını etkileyebileceğini göstermiştir6,7,8.

Biyomoleküler korona çalışmalarında, karakterizasyonu, korona oluşumu, korona içindeki biyomoleküllerin izolasyonu, nitel veya nicel kütle spektrometresi ile tespiti ve tanımlanması için dört farklı aşama vardır9. Bugüne kadar, SDS-PAGE çalışan tamponda kaynatma, çözücü ve tuz ekstraksiyonları veya NM’lerin yüzeyinde in situ proteinlerin doğrudan sindirimi de dahil olmak üzere protein koronasını izole etmek için bir dizi teknik benimsenmiştir. Koronadaki metabolitler açısından, izolasyon çözücüler kullanılarak çeşitli yöntemlerle daha karmaşıktır ve hatta çözelti olarak önerilen NM’lerin çözünmesi8,10,11. Bununla birlikte, protein koronasının aksine, metabolom tarafından işgal edilen geniş kimyasal alan ve olası NM’lerin çeşitliliği nedeniyle, NM’lerden metabolitlerin izolasyonu için “herkese uyan bir boyut” yaklaşımının uygulanması olası değildir. Alternatif bir yaklaşım, NM maruziyeti öncesi ve sonrası biyolojik matrisi, metabolitlerin NM’lere adsorpsiyonuna atfedilen metabolit konsantrasyonlarındaki farkla karakterize etmektir.

Bu alternatif yaklaşım tüm biyofluidler ve NM’ler için geçerli olacaktır ve iki kat daha fazla analiz gerektirmesine rağmen, sonuç olarak metabolit koronanın çok daha kesin bir ölçüsünü sunar ve NM yüzeyinden düşük metabolit geri kazanımlarının spesifik metabolitin düşük bağlanmasıyla karıştırılma riski yoktur.

Biyomoleküler korona analizinin ikinci adımı biyomoleküllerin tespitidir. Geleneksel olarak koronadaki proteinler için, bu proteomiğin çalışma atı olan nano-LC-MS’in havalesi olmuştur; NMR13 , 1Dve 2D SDS-PAGE gibi diğer yaklaşımlar da uygulanmıştır. Metabolit korona LC-MS7,GC-MS8 ve doğrudan infüzyon kütle spektrometresi açısından14. Bununla birlikte, son zamanlarda yeni bir yaklaşım çekiş kazanmaya başladı, yani kılcal elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS)11,15 ve NM laboratuvarlarında NM’lerin çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklerini karakterize etmek için bağımsız bir teknik olarakmevcuttur 16. CE-MS nanoLC-MS ve GC-MS için bir ortogonal ayırma tekniğidir ve yüksek polar ve yüklü metabolitlerin17,18algılanmasını sağlayabilir. Ayrıca, CE-MS proteinlerin analizi ve fosforilasyon ve glikosilasyon 19 , 20 ,21,22gibi posttranslational modifikasyonları için çokuygundur. Son adım, tanımlama ve veri analizi, nicel / nitel veya hedefli / hedefsiz bir yaklaşımın kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir, ancak bu, bu protokolün havalesinin dışında kalır.

CE ve nanoESI arayüzünün bir kombinasyonu olan CESI-MS, kılımsız bir arayüz kullanan CE teknolojisinde yeni bir gelişmedir. Bu, ultra düşük akışlı CE’nin (<20 nL/ dk) seyreltme olmadan yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine doğrudan bağlanmasına olanak tanır, bu da algılama hassasiyetinin önemli ölçüde iyileştirilmesine neden olur23,24,25. CESI-MS, hacim sınırlı numunelerin (< 10 μL) analizini sağlarken son derece hassas bir analizsağlar 26. CESI-MS ayrıca, tekrarlanabilirlik açısından proteomik ve metabolomiklerde kullanılan geleneksel düşük akış hızı nanoLC-MS yaklaşımları ile olumlu bir şekilde karşılaştırır27,28, aktarım hızı ve tam biyomoleküler korona karakterizasyonu için heyecan verici bir umut haline getirir.

CESI-MS’in biyo-nano etkileşimlerin analizleri için potansiyelini vurgulamak için bu çalışma, NM biyomoleküler koronayı tek bir insan plazma örneğinden izole etmek için gereken numune hazırlığını, tam biyomoleküler NM koronanın hem protein hem de metabolit yönlerinden verileri en üst düzeye çıkaracak şekilde açıklar. İnsan plazmasının kullanımı hakkında rapor verirken, bu protokol kan serumu, tam hücre kültürü ortamı, hücre lisat, beyin omurilik sıvısı veya idrar gibi diğer biyofelidler için eşit derecede uygun olacaktır. Bu iki bileşenin (proteinler ve metabolitler) analizleri daha sonra protein korona için nötr kaplı CESI kılcal damarları ve hem katyonik hem de aniyonik metabolitler için çıplak kaynaşmış silika kılcal damarlar kullanılarak tanımlanacaktır.

Protocol

Leiden Üniversitesi ve Innsbruck Tıp Üniversitesi’nin IRB protokol yönergelerine göre insan biyofluid kullanımı onaylandı. İnsan veya hayvan biyokütleleri araştırılırken, araştırma kurumundan etik onay alınması gerekmektedir ve bu protokolde gösterilen sonuçlar durumunda elde edilmiştir. Ayrıca, gelecekteki çalışmalarda verilerin şeffaflığını ve yeniden kullanılabilirliğini sağlamak için yeterli raporlama da yapılmalıdır9,29,30. 1. Arka plan elektrolitlerinin hazırlanması (BGE) NOT: Tüm çözücüler uygun bir duman kaputunda hazırlanmalı ve tüm adımlar (labcoat, eldiven ve gözlükler) için yeterli kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Her adımda, numunenin züccaciyeden sızmış tuzlarla analit kaybını ve kirlenmesini en aza indirmek için düşük bağlayıcı plastik şişeler gereklidir. Metabolomik için günlük olarak asetik asit BGE (v/v), pH 2.2 hazırlayın. 10 mL hacimsel şişeye 1 mL asetik asit ekleyin, ardından işaretli çizgiye deiyonize (DI) su eklenmesi ve iyice karıştırılması. Proteomik için günlük olarak 100 mM asetik asit, pH 2.9 hazırlayın. 10 mL hacimsel şişeye 57 μL asetik asit ekleyin, ardından işaretli çizgiye DI suyu ekleyin ve iyice karıştırın. 2. NM hazırlığı Yayınlanan31, 32,33kılavuzlarını kullanarak NM’leri suya kuvvetlice dağıtin.NOT: Bu protokolün geliştirilmesinde 7 NM şu şekilde kullanılmıştır: Protein ve metabolit korona için sırasıyla 100 ve 1.000 nm karboksilat polistiren kullanılmıştır. Hem protein hem de metabolit koronalar için 100 nm değiştirilmemiş polistiren NM’ ler, 13 nm anataz TiO2 NM’ler, hem protein hem de metabolit koronalar için değiştirilmemiş veya poliakrilat veya PVP polimerleri ile kaplanmış22 nm değiştirilmemiş SiO 2 NM’ler kullanılmıştır. Yöntem bu NM’ler kullanılarak geliştirilir ve gösterilirken, bu yaklaşımın çok çeşitli NM kompozisyonları, boyutları, şekilleri ve morfolojileri için geçerli olacağı belirtilmelidir. Dinamik ışık saçılımı kullanarak parçacık boyutunu karakterize34,35, tek parçacık endüktif olarak birbirine bağlı plazma kütle spektrometresi36, nanopartikül izleme analizi37veya iletim elektron mikroskopisi ve yüzey yükü zeta boyutu kullanarak zeta potansiyeliolarak 34. 3. Biyomoleküler korona oluşumu 2 mL insan plazmasını (veya tercihi biyofluid) metabolit ve protein korona için ve ikincisi plazma metabolome karakterizasyonu için olmak üzere 1 mL aliquots’a bölün. bir termokserde 500 rpm’de hafifçe karıştırırken, insan plazmasında 1 mg/mL NM’yi 37 °C’de 1 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka santrifüjü takiben, NM’leri peletmek için numuneyi 4 °C’de 15 dakika boyunca 4.000 x g’da santrifüj edin. Metabolit korona analizi için plazma süpernatantını toplayın. Protein korona karakterizasyonu için NM-protein korona kompleksini koruyun. 4. Protein korona izolasyonu İlişkisiz proteinleri çıkarmak için NM-protein kompleksini (pelet) 1 mL 10x PBS Tampon ve girdapta 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde yeniden depolar. NM’leri peletmek için PBS çözeltisini 4 °C’de 15 dakika boyunca 4.000 x g’da santrifüj edin ve peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. İlişkisiz proteinleri ve istenmeyen tuzları çıkarmak için peletin 1 mL amonyum bikarbonat tamponunda (ABC) (100 mM, pH 8.0) ve girdapta 2 dakika boyunca kuvvetlice yeniden depolayın. NM’leri peletmek için 4 °C’de 15 dakika boyunca 4.000 x g’da santrifüj; üstnatant kaldırmak ve atmak. Bu adımı yineleyin. NM-protein peletini 10 mM dithiotheritol içeren 20 μL ABC tamponunda (100 mM pH 8) eriterek protein disülfid bağlarını azaltın. Azaltma çözeltisini 56 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Proteinleri sindirmek için, %0,1 yüzey aktif madde içeren 20 μL ABC’ye 2 μg dizileme sınıfı Trypsin ekleyin. Sindirme çözeltisini 37 °C’de 16 saat kuluçkaya yatırın. 100 mM ABC’de 55 mM’de 20 μL iodoasetamid ilavesi ile numuneyi alkylate edin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Yüzey aktif maddeyi ayırmak için 20 μL 0,1 M HCl ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. C18 paketlenmiş tuzdan arındırma pipet ucu kullanarak peptitleri zenginleştirin ve tuzdan arındıryın. Ucu 80 μL% 0.1 formik asit% 50 asetonitril ile 5 kez ıslatın, 80 μL% 0.1 formik asit ile 5 kez temizleyin, numuneyi 10 kez çekin ve elüte edin, 80 μL 0.1% formik asidi 5 kez yıkayarak numuneyi tuzdan arındırın ve numuneyi 80 μL% 0.1 formik asit% 70 asetonitül ile temiz bir düşük bağlayıcı PCR tüpüne 2 kez boşaltın. Numuneleri liyofilize edin ve analize kadar -20 °C’de saklayın. 5. Metabolit korona izolasyonu Adım 3.3’ten NM plazma inkübasyonundan kontrol plazmasını ve süpernatantı alın ve numune hazırlama sırasında buzda tutun. Her birinden 50 μL’yi ayrı şişelere alın ve 10’da 1’ini DI suyuyla seyreltin. Seyreltilmiş her numuneden 50 μL alın ve adım 5.3 için yeni şişelere geçin. 2 dakika boyunca 200 μL kloroform, 250 μL metanol ve 350 μL DI su ve kuvvetli girdap karışımı ekleyin. 4 °C’de 20.800 x g’da 10 dakika santrifüj. 500 μL süpernatant alın ve 4 °C’de 10.000 x g’da 2 saat boyunca 3 kDa santrifüj filtreden filtreleyin. 430 μL ultrafiltrat alın ve bir hız vac kuru. Numuneler artık analizden önce dondurulabilir. 6. CESI-MS sisteminin hazırlanması38 NOT: Kılcal damarların montajından önce, kılcal damarların giriş ve çıkış ucunun sağlam olup olmadığını ve kılcal damarda görünür kırılma olmadığını kontrol edin. Protein korona analizi için nötr kaplamalı kılcal damarların montajı39. Cesi cihazına üretici yönergelerine uygun olarak yeni bir nötr kaplamalı kılcal damar (30 μm iç çapı ile 90 cm uzunluğunda) yerleştirin. Proteomik analiz için CESI kılcal damarlarının hazırlanması. Ayırma kılcal damarını 100 psi’de 5 dakika boyunca 100 mM HCl kullanarak ileri yönde yıkayın ve kılcal damarın çıkışında damlacık oluşumunu kontrol edin. Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 100 psi’de BGE ve ardından 30 dakika boyunca 100 psi’de DI suyu ile yıkayın (bu sadece yeni kılcal damarlar için gereklidir). Hem ayırma kılcal damarını hem de iletken kılcal damarı 5 dakika boyunca 90 psi’de BGE ile yıkayın ve her iki kılcal damarın çıkış ucunda damlacıklar oluşmasını sağlayın. Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 90 psi’de DI suyla yıkayın, ardından 0.1 M HCl ile 10 dakika boyunca 50 psi, ardından 10 dakika boyunca DI su ile 90 psi ve son olarak 10 dakika boyunca 90 psi’de BGE. CESI’yi daha önce açıklandığı gibi bir nanospray kaynağı ve adaptörü kullanarak MS’e ikiyekatla 38. Metabolit korona karakterizasyonu için çıplak kaynaşmış silika kılcal damarların montajı38. Cesi cihazına üretici yönergelerine uygun olarak yeni bir çıplak kaynaşmış silika kılcal damar (30 μm iç çapa sahip 90 cm uzunluğunda) yerleştirin. Metabolomik analiz için CESI kılcal damarlarının hazırlanması. Ayırma kılcal damarını 15 dakika boyunca 50 psi’de 0 MeOH kullanarak ileri yönde yıkayın ve kılcal damarın çıkışında damlacık oluşumunu kontrol edin. Hem ayırma kılcal damarını hem de iletken kılcal damarı 5 dakika boyunca 90 psi’de BGE ile yıkayın ve her iki kılcal damarın çıkışında damlacıkların oluşmasını sağlayın. Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 90 psi’de DI suyla, ardından 0.1 M NaOH ile 10 dakika boyunca 50 psi ile yıkayın, ardından 10 dakika boyunca DI su ile 90 psi ve son olarak 10 dakika boyunca 90 psi’de BGE. CESI’yi daha önce açıklandığı gibi bir nanospray kaynağı ve adaptörü kullanarak ESI-MS’e bir çift. 38 7. Protein korona analizi için CE-MS 50 mM amonyum asetat pH 4.0’ın 20 μL’sinde 4.8 adımından örnekleri yeniden biriktirin. Numunenin 5 psi 10 s hidrodinamik enjeksiyonu gerçekleştirin. Aşağıdaki basınç gradyanıyla 30 kV ayırma voltajı kullanarak ayırın: 1 psi’de 0-10 dk, 1,5 psi’de 10-35 dk ve 100 mM kullanarak 5 psi’de 35-45 dk, BGE olarak pH 2.9 asetik asit. 250-2000 m/z arasındaki kütle spektrumlarını toplayın ve en iyi 10 veriye bağımlı parçalanma alımı. Numuneler arasında, 100 psi’de 3 dakika ve ayırma kılcal damarı için 10 dakika 100 psi BGE ve iletken sıvı kılcal damar için 100 psi’de 3 dakika boyunca 0,1 M HCl ile kılcal damarları durulayın. 8. Metabolit korona analizi için CESI-MS NOT: Tüm numuneler, katyonların tespiti için pozitif modda ve bir kez de sonyonların tespiti için negatif modda olmak üzere iki kez analiz edilmelidir. Kontrol plazma örneklerinin en az 5 kez analiz edilmesi gerekir. 430 μL DI su ve 2 dakika boyunca güçlü bir girdapta 5.4 adımından NM maruz kalan ve pozlanmamış plazma örneklerini yeniden depolayın. 0,1 μm membran filtresinden filtreleyin. 95 μL filtrat alın ve katyonlar için 200 μM’de 5 μL iç standart (L-methionine sülfin) ve anionlar için 400 μM (2,2,4,4-D4-sitrik asit) ve girdabı kuvvetlice ekleyin. CESI-MS analizi öncesinde 10 dakika boyunca 4 °C’de 4.000 x g’da santrifüj. Numuneyi 2 psi’de 30 s (katyon) ve 40 s (anion) için hidrodinamik olarak enjekte edin. Metabolitleri ileri (cations) ve ters (anionlar) modda 30 kV ayırma voltajı ile% 10 asetik asitte ayırın. Ters ayırma modu, ayırma kılcal damarı üzerinde 0,5 psi ileri basınç ile desteklenir. Kütle aralığı 65-1000 m/z üzerinde pozitif (cations) veya negatif (anionlar) modda veri toplamak için kütle spektrometresini ayarlayın. Numuneler arasında, 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI su ve BGE ile kılcal damarları 2 dakika boyunca 50 psi’de durulayın.

Representative Results

Açıklanan yöntem, aynı insan plazma örneğini kullanarak NM biyomoleküler koronadaki proteinleri ve metabolitleri karakterize eden ilk yöntemdir. Bu yöntem, >200 proteinleri ve >150 metabolitleri tespit edebilir, böylece tam biyomoleküler koronanın en kapsamlı genel görünümünün belirlenmesini sağlayarak NM hücresel bağlanma, alım ve etkilerin daha iyi anlaşılmasını sağlar. CESI-MS’in hem proteomik (Şekil 1) hem de metabolomik (Şekil 2) ayırma ve algılama için kullanılması, her yaklaşım için her iki kılcal damarda da iyi ayırma pencereleri göstermektedir. Bu yöntem, çok çeşitli NMs bileşimlerinde koronadaki proteinleri ayırt edebilir, böylece yöntemlerin çok çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklerde NM’lere uygulanabilirliğini gösterir (Tablo 1). Metabolit koronanın benzersiz parmak izleri de bu metodolojinin metabolomik dalı kullanılarak ayırt edilebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım NM metabolit koronayı karakterize etmek için pasif bir yaklaşım kullansa da, izomerlerin diferansiyel adsorpsiyonu gibi biyomoleküler koronada metabolitlerin rolüne dair ilginç içgörüler ortaya çıkarabilir (Şekil 4). Şekil 1: Parçacık üzerinde bir sindirimi takiben CESI-MS kullanılarak bir SiO2 protein korona ayrımının örnek elektroferogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Plazmadaki endojen bileşiklerden CE-MS tarafından elde edilen ayıklanmış iyon elektroferogramları örneği. Numaralı bileşikler şunlardır: 1. Ornitin; 2. Lizin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glicin; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Izolösin; 10. Lösin; 11. Serine; 12. Threonine; 13. Kuşkonmaz; 14. Methionine; 15. Glutamin; 16. Glutamik asit; 17. Fenil-D5-alanin; 18. Fenilalanin; 19. Tırozin; 20. Proline; 21. Methionine sülfiton (iç standart). Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlandı ve Zhang veark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: 6 NMs dizisinde protein korona analizi. Silika (SiO2),titania (TiO2),PVP kapaklı titania (TiO2-PVP), dispex capped titania (TiO2-Dispex), polistiren ve karboksillenmiş polistiren NM’lerde tanımlanan protein sınıflarının ısı haritası. Yüzdeler, proteinlerin her protein için en iyi 3 peptit bolluğuna dayanan toplam protein içeriğine göre bolluğunu ifade eder. Farklı NM koronalarındaki proteinlerin göreceli bolluklarında gözlenen farklılıklar göz önüne alındığında, bu önerilen protokolün farklı NM’lerin protein koronası arasında ayrım yapmak için yeterince hassas olduğu açıktır. Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlanan protein koronasının CESI-MS analizinden çoğaltılan şekil11. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: NM koronasında katyonik metabolitlerin hedefli analizi. SiO2 ve TiO2 NM’lere yapılan atıfların adsorpsiyonu. Kırmızı, metabolitlerin ilk konsantrasyonunu ifade ederken, mavi 37 °C’de NM’lerle 1 saat inkübasyonu takiben metabolitlerin konsantrasyonunu ifade eder. Çözeltideki metabolit konsantrasyonundaki azalma, NM yüzeyine metabolit adsorpsiyonunun bir sonucudur. Polistiren NM’ler için metabolitlerin önemli bir adsorpsiyonunun gözlenmedi. Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlanan metabolit koronanın CESI-MS hedefli analizinden elde edilen şekil15. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: NM koronadaki anionik metabolitlerin izomer adsorpsiyonu odaklı hedefli analizi. Bir dizi titania NM’ye anionların adsorpsiyonlanması, şeker fosfatları gibi çeşitli izomerler arasında açık farklar olduğunu göstermektedir. Kırmızı, metabolitlerin ilk konsantrasyonunu ifade ederken, mavi 37 °C’de NM ile 1 saat inkübasyonu takiben metabolitlerin konsantrasyonunu ifade eder. Çözeltideki metabolit konsantrasyonundaki azalma, NM yüzeyine metabolit adsorpsiyonunun bir sonucudur. SiO2 için metabolitlerin önemli bir adsorpsiyonunun gözlenmedi ve polistiren NM’ler. Kutu çizimleri minimum ve maksimum değerleri, ortanca ve interquartile aralıklarını temsil eder. Açık erişimli Creative Common CC BY lisansı altında yayınlanan metabolit koronanın CESI-MS hedefli analizinden çoğaltılan şekil15. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Analit Ortalama RSD tepe alanı Ortalama RSD geçiş süresi 1928 peptitler gün içi (n=3) 15% 0.30% Gün içinde 27 gösterim (n=16) 5.80% 2.20% 27 gün içi katyon (n=36) 8.60% 1.80% Tablo 2: Peptitler ve katyonik metabolitler için CESI-MS teknik kopyalarının tekrarlanabilirliği. RSD: tekrarlanabilirlik ölçüsü olarak göreli standart sapma. CESI-MS’in yoğun alanlar ve geçiş süreleri açısından tekrarlanabilirliği çok iyidir, tüm analizler ortalama RSD’ye <15% ve göç süreleri% 2.2 < sahiptir. Bu sonuçlar, bu teknik kullanılarak toplanan verilere atfedilebilecek yüksek güven derecesini gösterir ve tespit edilen varyasyonların analitik varyasyon yerine örnek bileşimindeki (NM'lerde zenginleştirme) gerçek farklılıklardan kaynaklandığını doğrular. Tablo 2, daha önce11,15olarak sunulan sonuçlardan oluşturulur.

Discussion

Bu, CESI-MS kullanarak aynı örnekten proteinleri ve metabolitleri içeren tam biyomoleküler koronayı karakterize etmek için önerilen ilk yöntemdir. Aynı örnekten hem proteinleri hem de metabolitleri karakterize etme yeteneği, korona oluşum sürecine ve NANOMEDIKİNLER olarak NMs toksisitesi ve etkinliği için etkilerine ilişkin yeni içgörüler sağlayan tek bir deneysel maruziyetten toplanan veri miktarını önemli ölçüde artıracaktır. Ayrıca, CESI-MS, her iki biyomolekül sınıfını da sadece kılcal damar değişikliği ile karakterize etmek için ideal bir platformdur. İleriye doğru, sulu olmayan CE için geliştirilen yeni yöntemler lipidomiklerin CE-MS40 kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlayacaktır, böylece proteinleri, metabolitleri ve lipitleri tek bir platform kullanarak analiz etmek artık mümkündür. Mevcut konvansiyonel yaklaşımlar, biri protein koronası ve diğeri metabolit korona için olmak üzere iki özel LC-MS platformu gerektirecektir. Böylece, bu yaklaşım tek bir analitik platform kullanarak iki kat daha fazla veri toplayabilir.

Bu protokol koronanın dolaylı olarak ölçülmeyi önerdiğinden, özellikle metabolit korona ile ilgili bu yaklaşımda bazı uyarılar vardır. Bu nedenle, metabolit seviyeleri NM’lere göre yüksek konsantrasyonlarda mevcut olduğunda ve matriste metabolit konsantrasyonundaki sonraki düşüş küçük olduğunda sorun ortaya çıkabilir. Bununla birlikte, protein koronasının aksine, her NM’nin benzersiz yüzey kimyalarına sahip olması nedeniyle metabolit koronayı izole etmek için “herkese uyan bir boyut” yaklaşımının geliştirilmesi olası değildir. İleride, metabolit koronayı izole etmek için NM’ye özgü yaklaşımların geliştirilmesi ve doğrulanmış olması daha olasıdır; bu yalnızca belirli bir NM için geçerli olacaktır. Buna rağmen, CESI-MS, polar yüklü metabolitlerin nasıl izole edildiklerine bakılmaksızın karakterizasyonu için hala son derece uygun bir platform olacaktır. Ayrıca dikkat çekici olan, NM’leri peletmek için tasarlanmış santrifüjleme adımları sırasında bir pelet oluşmazsa, daha yüksek bir santrifüj kuvveti gerekebilir; bu büyük olasılıkla daha az yoğun NM’lerde ortaya çıkar. Kılcal damarların dar deliği nedeniyle tüm filtreleme adımlarına protokol içinde uyulması da önemlidir, herhangi bir partikül madde numuneden yeterince ortadan kaldırılmamışsa bunlar kolayca engellenebilir.

Protein korona birkaç yıldır yoğun bir araştırma alanı olsa da, bunu metabolit korona ile birleştirme yeteneği, biyo-nano arayüz6,14‘ü araştıran bilim adamları için yeni bir ilgi alanıdır. Bugüne kadar, bu çalışmaların çoğunluğu metabolit korona9,28’inpolar olmayan lipid fraksiyonu üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu akım yöntemi, enerji metabolizması, glikoliz ve DNA sentezinde yer alan önemli metabolitleri içeren koronadaki yüksek polar ve yüklü metabolitlerin karakterize edilmesine olanak tanır. Sonuç olarak, proteomik iş akışı ile birleştirildiğinde, biyomoleküler koronanın daha bütünsel bir karakterizasyonu mümkündür. Bu, ilerleyen biyo-nano etkileşimlerin daha derinlemesine analizini sağlar. Bu yöntem, protein ve metabolit etkileşimleri yoluyla reseptör aracılı endositoz hakkında gelişmiş mekanistik içgörüler sağlar. Ayrıca proteinler ve küçük moleküller arasındaki korona içi ve intra etkileşimler araştırılabilir; örneğin, son zamanlarda koronadaki proteinlerin metabolitlerin işe alınmasında kilit bir rol oynadığı gösterilmiştir15. Şekil 3 ve Şekil 4’teki temsili sonuçların metabolitlerin mutlak nicelemesi olduğunu belirtmek gerekir, ancak, maruz kalan plazmaya kıyasla kontrollerdeki tüm CE-MS özelliklerini karşılaştırmak için çok değişkenli veri analizi kullanan hedefsiz bir yaklaşım metabolit bağlamayı da aydınlatacak olacaktır. Bu nedenle, metabolitlerin ve proteinlerin NM koronalarına nasıl ve hangi işe alımlarını etkilediğini araştırmak için önemli bir kapsam vardır. Bu ek çalışmalar, nanotıpların teslimatını optimize etmek veya biyomoleküler korona engelleme veya hedefleme işlevlerini maskeleme nedeniyle farmasötik eylemin bastırılması gibi gelişimlerinin önündeki engelleri ortaya çıkarmak için koronaların tasarlanmasına yardımcı olabilir.

CESI-MS, yaklaşık 20 nL/dk’lik nano ölçekli akış hızları ve organik çözücülerin minimum kullanımı ile, sırasıyla metabolomik ve proteomik çalışmalar için temel zorluklar olan solvent kullanımı açısından standart LC-MS ve nanoLC-MS’e göre yeşil ve ekonomik kimlik bilgilerinde bir iyileşme sunmaktadır. CESI-MS, LC-MS tabanlı yöntemler11,15ile olumlu bir şekilde karşılaştıran hem geçiş süresi hem de pik alan için oldukça tekrarlanabilir sonuçlar sunar. Ayrıca, nanoLC-MS ile karşılaştırıldığında, taşıma CESI-MS’te bir sorun değildir. Bu nedenle, numune analizleri arasında kapsamlı sistem temizliği gerekli değildir, bu da numune verimini büyük ölçüde artırır11.

Özetle, önerilen iş akışı, NM’lerin tam biyomoleküler koronasının hem protein hem de metabolit bileşenlerini karakterize etmek için bir yaklaşımı detaylandıran ilk iş akışıdır. Bu, biyo-nano etkileşimlerin yeni bir yönünün kilidini açar, metabolit korona, böylece aynı örnekten iki kat daha fazla verinin toplanmasını sağlayarak biyo-nano arayüzdeki etkileşimlerin daha eksiksiz anlaşılmasını sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.J.C, J.A.T ve I.L, Horizon 2020 projesi ACEnano aracılığıyla Avrupa Komisyonu’ndan fon sağlamayı kabul ediyor (Hibe no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z, Çin Burs Konseyi’nden (CSC, No. 201507060011) doktora fonunu kabul eder. R.R, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nün Vidi hibe programının finansal desteğini kabul etmektedir (NWO Vidi 723.0160330).

Materials

1,4-Dithiothreitol Sigma 10197777001
2,2,4,4-D4-citric Simga 485438-1G Internal standard anion
Ammonium Acetate >98% Sigma A1542
Ammonium Bicarbonate >99.5% Sigma 09830
Capillary cartridge coolant Sciex 359976
CESI 8000 instrument Sciex A98089
CESI Cap Sciex B24699
CESI Vials Sciex B11648
Chloroform Sigma 650498 Toxic, use in a fume hood
Glacial Acetic acid Sigma A6283
Hydrochloric acid 1mol/L Sigma 43617
Iosoacetamide Sigma I1149
L-methionine sulfone Sigma M0876-1G Internal standard cation
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) Sigma 14262 Use in a fume hood
Microvials Sciex 144709
nanoVials Sciex 5043467
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length Sciex B07368
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source Sciex B07363 B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length Sciex B07367
Phospahte buffered saline 10x Sigma P7059
Pierce C18 Tips, 100 µL bed Thermo Fisher Scientific 87784
Polystyrene 100 nm Polysciences Inc 876
Polystyrene carboxylated 100 nm Polysciences Inc 16688
Polystyrene carboxylated 1000 nm Polysciences Inc 08226
Rapigest SF (surfactant) Waters 186001860
Sequencing Grade modified Trypsin Promega V5111
SiO2 Ludox TM-40 Sigma 420786
Sodium Hydroxide solution Simga 72079
TiO2 Dispex coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 PVP coated Promethion particles Bespoke particles
TiO2 uncoated Promethion particles Bespoke particles
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, P. C., Lin, S., Parak, W. J., Davis, T. P., Caruso, F. A Decade of the Protein Corona. ACS Nano. 11 (12), 11773-11776 (2017).
  2. Sasidharan, A., Riviere, J. E., Monteiro-Riviere, N. A. Gold and silver nanoparticle interactions with human proteins: impact and implications in biocorona formation. Journal of Materials Chemistry B. 3 (10), 2075-2082 (2015).
  3. Albanese, A., et al. Secreted biomolecules alter the biological identity and cellular interactions of nanoparticles. ACS Nano. 8 (6), 5515-5526 (2014).
  4. Lynch, I., Dawson, K. A. Protein-nanoparticle interactions. Nano Today. 3 (1-2), 40-47 (2008).
  5. Tenzer, S., et al. Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nature Nanotechnology. 8 (10), 772-781 (2013).
  6. Chetwynd, A. J., Lynch, I. The rise of the nanomaterial metabolite corona, and emergence of the complete corona. Environmental Science: Nano. 7 (4), 1041-1060 (2020).
  7. Lee, J. Y., et al. Analysis of lipid adsorption on nanoparticles by nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 1-10 (2018).
  8. Pink, M., Verma, N., Kersch, C., Schmitz-Spanke, S. Identification and characterization of small organic compounds within the corona formed around engineered nanoparticles. Environmental Science: Nano. 5 (6), 1420-1427 (2018).
  9. Chetwynd, A. J., Wheeler, K. E., Lynch, I. Best practice in reporting corona studies: Minimum information about Nanomaterial Biocorona Experiments (MINBE). Nano Today. 28, 100758 (2019).
  10. Zhang, H., et al. Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteins classifies nanoparticles with different surface properties and size. Proteomics. 11 (23), 4569-4577 (2011).
  11. Faserl, K., Chetwynd, A. J., Lynch, I., Thorn, J. A., Lindner, H. H. Corona isolation method matters: Capillary electrophoresis mass spectrometry based comparison of protein corona compositions following on-particle versus in-solution or in-gel digestion. Nanomaterials. 9 (6), 898 (2019).
  12. Nasser, F., Lynch, I. Secreted protein eco-corona mediates uptake and impacts of polystyrene nanoparticles on Daphnia magna. Journal of Proteomics. 137, 45-51 (2016).
  13. Hellstrand, E., et al. Complete high-density lipoproteins in nanoparticle corona. FEBS Journal. 276 (12), 3372-3381 (2009).
  14. Grintzalis, K., Lawson, T. N., Nasser, F., Lynch, I., Viant, M. R. Metabolomic method to detect a metabolite corona on amino functionalised polystyrene nanoparticles. Nanotoxicology. , 1-12 (2019).
  15. Chetwynd, A. J., Zhang, W., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R. The nanomaterial metabolite corona determined using a quantitative metabolomics approach: A pilot study. Small. , (2020).
  16. Chetwynd, A. J., Guggenheim, E. J., Briffa, S. M., Thorn, J. A., Lynch, I., Valsami-Jones, E. Current application of capillary electrophoresis in nanomaterial characterisation and its potential to characterise the protein and small molecule corona. Nanomaterials. 8 (2), 99 (2018).
  17. Zhang, W., et al. Assessing the suitability of capillary electrophoresis-mass spectrometry for biomarker discovery in plasma-based metabolomics. Electrophoresis. , 00126 (2019).
  18. Ramautar, R., Somsen, G. W., de Jong, G. J. CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period 2016-2018. Electrophoresis. 40 (1), 165-179 (2019).
  19. Sarg, B., Faserl, K., Lindner, H. H. Identification of novel site-specific alterations in the modification level of myelin basic protein isolated from mouse brain at different ages using capillary electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 17 (19), 1700269 (2017).
  20. Faserl, K., Sarg, B., Maurer, V., Lindner, H. H. Exploiting charge differences for the analysis of challenging post-translational modifications by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1498, 215-223 (2017).
  21. Zhang, Z., Qu, Y., Dovichi, N. J. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for bottom-up proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 108, 23-37 (2018).
  22. Shen, X., et al. Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry for top-down proteomics. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. 120, 115644 (2019).
  23. Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (2), 885-892 (2012).
  24. Faserl, K., Kremser, L., Müller, M., Teis, D., Lindner, H. H. Quantitative proteomics using ultralow flow capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (9), 4633-4640 (2015).
  25. Faserl, K., Sarg, B., Kremser, L., Lindner, H. Optimization and evaluation of a sheathless capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry platform for peptide analysis: comparison to liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (19), 7297-7305 (2011).
  26. Segers, K., et al. CE-MS metabolic profiling of volume-restricted plasma samples from an acute mouse model for epileptic seizures to discover potentially involved metabolomic features. Talanta. 217, 121107 (2020).
  27. Chetwynd, A. J., David, A. A review of nanoscale LC-ESI for metabolomics and its potential to enhance the metabolome coverage. Talanta. 182, 380-390 (2018).
  28. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-Mass spectrometry at trial by metabo-ring: Effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  29. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
  30. Leong, H. S., et al. On the issue of transparency and reproducibility in nanomedicine. Nature Nanotechnology. 14 (7), 629-635 (2019).
  31. Kaur, I., et al. Dispersion of nanomaterials in aqueous media: Towards protocol optimization. Journal of Visualized Experiments. (130), e56074 (2017).
  32. Bihari, P., et al. Optimized dispersion of nanoparticles for biological in vitro and in vivo studies. Particle and Fibre Toxicology. 5 (1), 1-14 (2008).
  33. Taurozzi, J. S., Hackley, V. A., Wiesner, M. R. Ultrasonic dispersion of nanoparticles for environmental, health and safety assessment – and recommendations. Nanotoxicology. 5 (4), 711-729 (2011).
  34. Lu, P. J., et al. Methodology for sample preparation and size measurement of commercial ZnO nanoparticles. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 628-636 (2018).
  35. Langevin, D., et al. Inter-laboratory comparison of nanoparticle size measurements using dynamic light scattering and differential centrifugal sedimentation. NanoImpact. 10, 97-107 (2018).
  36. Lee, S., Bi, X., Reed, R. B., Ranville, J. F., Herckes, P., Westerhoff, P. Nanoparticle size detection limits by single particle ICP-MS for 40 elements. Environmental Science and Technology. 48 (17), 10291-10300 (2014).
  37. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  38. Zhang, W., Gulersonmez, M. C., Hankemeier, T., Ramautar, R. Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples. Journal of Visualized Experiments. , e54535 (2016).
  39. Faserl, K., Sarg, B., Lindner, H. H. Application of CE-MS for the analysis of histones and histone modifications. Methods. , (2020).
  40. Azab, S., Ly, R., Britz-Mckibbin, P. Robust method for high-throughput screening of fatty acids by multisegment injection-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry with Sstringent quality control. Analytical Chemistry. 91 (3), 2329-2336 (2019).
  41. Zhang, X., Pandiakumar, A. K., Hamers, R. J., Murphy, C. J. Quantification of lipid corona formation on colloidal nanoparticles from lipid vesicles. Analytical Chemistry. 19 (24), 14387-14394 (2018).

Tags

Capillary ElectrophoresisMass SpectrometryCESI-MSProtein CoronaMetabolite CoronaNanomaterialsHuman PlasmaProtein CharacterizationMetabolite CharacterizationTrypsin DigestionC18 DesaltingSample Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chetwynd, A. J., Zhang, W., Faserl, K., Thorn, J. A., Lynch, I., Ramautar, R., Lindner, H. H. Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials. J. Vis. Exp. (164), e61760, doi:10.3791/61760 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image