Summary

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Published: February 23, 2021
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Summary

MAPS技術は、生体内の特定の調節RNAの標的を精査するために開発されました。目的のsRNAは、そのRNAパートナーの共精製とRNAシーケンシングによるそれらの同定を可能にするMS2アプタマーでタグ付けされます。この改変プロトコルは、特にグラム陽性菌に適しています。

Abstract

小さな調節RNA(sRNA)は、生命の細菌領域の間で広く普及しているが、それらの多くの機能は、彼らのmRNA標的を同定するのが難しいため、特に十分に特徴付けられていない。ここでは、RNAシーケンシング(MAPS)技術と組み合わせたMS2-アフィニティ精製の改変プロトコルについて説明し、インビボで特定のsRNAのすべてのRNAパートナーを明らかにすることを目指した。大まかに言えば、MS2アプタマーは、関心のあるsRNAの5’の端部に融合する。この構築物は、次いで生体内で発現され、MS2-sRNAがその細胞パートナーと相互作用することを可能にする。細菌の収穫後、細胞は機械的に取り付けられる。粗抽出物は、以前にマルトース結合タンパク質に融合したMS2タンパク質でコーティングされたアミロースベースのクロマトグラフィーカラムにロードされます。これにより、MS2-sRNAおよび相互作用RNAの特異的な捕獲が可能になります。溶出後、共精製RNAは、ハイスループットRNAシーケンシングとその後のバイオインフォマティクス解析によって同定されます。以下のプロトコルは、ヒトの植物体の黄色 ブドウ球菌 のグラム陽性で実施されており、原則として、任意のグラム陽性菌にトランスポーザブルである。要するに、MAPS 技術は、特定の sRNA の規制ネットワークを深く探索する効率的な手法を構成し、そのターゲットのスナップショットを提供します。しかし、MAPSによって特定された推定ターゲットは、補完的な実験的アプローチによって検証される必要があることを覚えておいてください。

Introduction

ほとんどの細菌ゲノムでは、何百もの、おそらく何千もの小さな調節RNA(sRNA)が同定されていますが、その大部分の機能は依然として特徴付けられません。全体として、sRNAは短い非コード分子であり、細菌生理学および変動環境への適応において主要な役割を果たしている1、2、3である。確かに、これらの高分子は、代謝経路、ストレス応答だけでなく、毒性および抗生物質耐性にも影響を与え、多数の複雑な調節ネットワークの中心にあります。論理的には、その合成は、特定の環境刺激(例えば、栄養飢餓、酸化または膜ストレス)によって引き起こされる。ほとんどの sRNA は、短いベースペアと非連続的な基本ペアを使用して、転写後レベルで複数のターゲット mRNA を調節します。彼らは通常、翻訳開始領域4のためにリボソームと競合することによって翻訳開始を防ぎます。sRNA:mRNA二重鎖の形成はまた、しばしば特定のRNasesのリクルートによって標的mRNAの活性分解をもたらす。

sRNA標的の特徴付け(すなわち、標的RNAのセット全体)は、それが介入する代謝経路およびそれが応答する潜在的なシグナルを同定することを可能にする。その結果、特定のsRNAの機能は、一般にその標的から推測することができる。この目的のために、インタRNAおよびCopraRNA5、6、7のようなインシリコ予測ツールの幾つかが開発されている。彼らは特に、推定sRNAパートナーを決定するために、潜在的な相互作用部位のエネルギーとアクセシビリティを組み合わせた、シーケンスの相補性に依存しています。しかし、予測アルゴリズムは、RNAシャペロン8の関与が最適でない相互作用または両パートナーの共発現を支持するなど、生体内での塩基対に影響を与えるすべての因子を統合するわけではない。その固有の制限により、予測ツールの誤検出率は依然として高いままです。大部分の実験的大規模アプローチは、sRNA:mRNAカップルがタグ付きRNA結合タンパク質(RBP)6,9と相互作用する共精製に基づいている。例えば、ライゲーションとシーケンシングによるRNA相互作用(RIL-seq)法により、エシェリヒア・コリ10,11におけるHfqおよびProQなどのRNAシャペロンと共精製されたRNA二重鎖を同定した。ハイブリッドのUV架橋、ライゲーションおよびシーケンシング(CLASH)と呼ばれる同様の技術が、大腸菌12,13のRNase E-およびHfq関連sRNAに適用された。複数の細菌におけるsRNA媒介性調節におけるHfqおよびProQの十分に記述された役割にもかかわらず、sRNAベースの調節は、S.アウレウス16、17、18のようないくつかの生物においてRNAシャペロン非依存性であるようである。RNasesに関連するRNA二重鎖の精製がウォーターズと同僚13によって示されるように実現可能であっても、これはRNasesが急速な劣化を引き起こすので難しいままです。したがって、RNAシーケンシング(MAPS)アプローチ19,20と結合したMS2-アフィニティ精製はこのような生物における固体代替を構成する。

上記の方法とは異なり、MAPSは、すべての相互作用RNAを捕捉するために餌として特定のsRNAを使用するため、RBPの関与に依存しません。プロセス全体を 図 1に示します。簡単に言えば、sRNAはMS2コートタンパク質によって特異的に認識されるMS2 RNAアプタマーで5’でタグ付けされます。このタンパク質は、アミロース樹脂上に固定化されるマルトース結合タンパク質(MBP)と融合している。したがって、MS2-sRNAおよびそのRNAパートナーは、アフィニティークロマトグラフィーカラム上に保持されます。マルトースとの溶出後、共精製RNAを、高スループットRNAシーケンシングを用いて、バイオインフォマティクス解析を行って同定する(図2)。MAPS テクノロジーは、最終的に、インビボで発生するすべての潜在的な相互作用の相互作用マップを描画します。

MAPS技術は、もともと非病原性グラム陰性細菌大腸菌21に実装されました。驚くべきことに、MAPSは、RyhBおよびRybB sRNAの両方と特異的に相互作用するtRNA由来の断片を同定し、非誘導条件でmRNA標的を調節するためのsRNA転写ノイズを防止するのに役立った。その後、MAPSはDsrA 22、RprA 23、CyaR23およびGcvB24のような他大腸菌sRNAに正常に適用された(表1)。MAPS は、以前に知られていた標的を確認した上で、これらの既知の sRNA のターゲットを拡張しました。最近、MAPSはサルモネラ・チフィムリウムで行われ、SraL sRNAがrho mRNAに結合することを明らかにし、転写終結因子25に対するコード化を行う。この組み合わせを通じて、SraLはRho自体によって引き起こされる早期転写終結からrho mRNAを保護する。興味深いことに、この技術はsRNAに限定されず、tRNA由来フラグメント26およびmRNA2の5’未翻訳領域の使用によって例示されるあらゆるタイプの細胞RNAに適用することができる(表1)。

MAPS法は、病原性グラム陽性菌S.アウレウス19にも適応されている具体的には、リシスプロトコルは、グラム陰性細菌よりも細胞壁が厚いため、細胞を効率的に破壊し、RNAの完全性を維持するために広く改変されている。この適応プロトコルは、すでにRsaA 27、RsaI28とRsaC29の相互作用を解明しました。このアプローチは、細胞表面特性、グルコース取り込み、および酸化ストレス応答の調節機構におけるこれらのsRNAの重要な役割に関する洞察を与えた。

2015年に 大腸菌 で開発され実装されたプロトコルは、最近では非常に詳細に説明されています30.ここでは、非病原性または病原性(安全上の注意)にかかわらず、グラム陽性(より厚い細胞壁)細菌におけるsRNA調節ネットワークの研究に特に適した改変MAPSプロトコルを提供する。

Protocol

1. バッファとメディア MAPS の実験では、次のバッファーとメディアを準備します。バッファ A (150 mM KCl、20 mM トリス-HCl pH 8、1 mM MgCl2 および 1 mM DTT)バッファE(250 mM KCl、20 mMトリス-HCl pH 8、12 mMマルトース、0.1%トリトン、1 mM MgCl2 および1 mM DTT)- RNAローディングバッファー(0.025%キシレンシアノール、8 M尿素中の0.025%ブロモフェノールブルー)脳心注?…

Representative Results

代表的な結果は、S. アウレウス29の RsaC 標的の研究に由来します。RsaCは型破りな1,116 nt-long sRNAである。その5’末端は、その3’の終わり(544 nt)が構造的に独立している間、いくつかの反復領域を含み、そのmRNA標的との全ての予測された相互作用部位を含む。このsRNAの発現は、マンガン(Mn)が不足しているときに誘導され、宿主免疫応答の文脈でしばしば遭遇する。MAPS技術…

Discussion

グラム陽性菌の改変プロトコル
MAPSの初期プロトコルは、モデル生物大腸菌20,30におけるsRNA相互作用を研究するために開発された。ここでは、日和見ヒト病原体S.アウレウスにおけるsRNA依存的調節ネットワークの特性評価に適し、他のグラム陽性菌、病原性であろうと確実にトランスポーズ可能な改変プロトコルについ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、「アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ」(ANR、グラントANR-16-CE11-0007-01、RIBOSTAPH、およびANR-18-CE12-002-002-04、CoNoCo、PR)によってサポートされました。また、将来のプログラムへの投資の一環としてANRが管理する国家からの資金として、LabEx NetRNA ANR-10-LABX-0036およびANR-17-EURE-0023(PRへ)の枠組みの下で出版されています。DLは、マリー・スウォトフスカ・キュリー補助金第753137-SaRNARegの下で欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムによって支援されました。E.マッセラボでの作業は、カナダ保健研究所(CIHR)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、国立衛生研究所NIHチームグラントR01 GM092830-06A1からの助成金を運営することによって支援されています。

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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