MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën
Summary
MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.
Abstract
Hoewel kleine regelgevende RNA’s (sRNAs) wijdverspreid zijn onder het bacteriële domein van het leven, blijven de functies van veel van hen slecht gekarakteriseerd, met name vanwege de moeilijkheid om hun mRNA-doelen te identificeren. Hier beschreven we een aangepast protocol van de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) technologie, met als doel alle RNA-partners van een specifieke sRNA in vivo te onthullen. In grote lijnen is de MS2 aptamer versmolten met het 5′ uiteinde van het sRNA van belang. Deze constructie wordt vervolgens in vivo uitgedrukt, waardoor de MS2-sRNA kan communiceren met zijn cellulaire partners. Na het oogsten van bacteriën worden cellen mechanisch gelyseerd. Het ruwe extract wordt geladen in een op amylose gebaseerde chromatografiekolom die eerder was bedekt met het MS2-eiwit dat is gesmolten met het maltosebindende eiwit. Dit maakt het mogelijk om MS2-sRNA specifiek vast te leggen en RNA’s te gebruiken. Na elutie worden co-gezuiverde RNA’s geïdentificeerd door RNA-sequencing met hoge doorvoer en daaropvolgende bio-informatische analyse. Het volgende protocol is geïmplementeerd in de Gram-positieve menselijke ziekteverwekker Staphylococcus aureus en is in principe transponeerbaar op grampositieve bacteriën. Kortom, MAPS-technologie is een efficiënte methode om het regelgevende netwerk van een bepaalde sRNA diep te verkennen en biedt een momentopname van het hele doeloom. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat putatieve doelstellingen die door MAPS zijn geïdentificeerd, nog steeds moeten worden gevalideerd door aanvullende experimentele benaderingen.
Introduction
Honderden, misschien zelfs duizenden kleine regelgevende RNA’s (sRNAs) zijn geïdentificeerd in de meeste bacteriële genomen, maar de functies van de overgrote meerderheid van hen blijven niet gekarakteriseerd. Over het algemeen zijn sRNAs korte niet-coderende moleculen, die een belangrijke rol spelen in de bacteriële fysiologie en aanpassing aan fluctuerende omgevingen1,2,3. Inderdaad, deze macromoleculen staan centraal in tal van ingewikkelde regulerende netwerken, die van invloed zijn op metabolische routes, stressreacties, maar ook virulentie en antibioticaresistentie. Logischerwijs wordt hun synthese geactiveerd door specifieke omgevingsprikkels (bijv. nutriëntenhongering, oxidatieve of membraanspanningen). De meeste sRNAs reguleren meerdere doel-mRNAs op posttranscriptieniveau door middel van korte en niet-aaneengesloten basiskoppeling. Zij verhinderen gewoonlijk de initiatie van vertalingen door te concurreren met ribosomen voor regio ‘s voor het initiëren van vertalingen4. De vorming van sRNA:mRNA duplexen resulteert ook vaak in de actieve afbraak van de doel mRNA door rekrutering van specifieke RNases.
De karakterisering van een sRNA-doeloom (d.w.z. de hele set van zijn doel-RNA’s) maakt het mogelijk om de metabolische routes te identificeren waarin het ingrijpt en het potentiële signaal waarop het antwoordt. Bijgevolg kunnen de functies van een specifiek sRNA in het algemeen worden afgeleid uit het doeloom. Hiervoor zijn verschillende in silico voorspellingstools ontwikkeld zoals IntaRNA en CopraRNA5,6,7. Ze vertrouwen met name op sequentie complementariteit, koppelingsenergie en toegankelijkheid van de potentiële interactiesite om putatieve sRNA-partners te bepalen. Voorspellingsalgoritmen integreren echter niet alle factoren die van invloed zijn op base-pairing in vivo, zoals de betrokkenheid van RNA-chaperonnes8 die suboptimale interacties of de co-expressie van beide partners bevorderen. Vanwege hun inherente beperkingen blijft het vals-positieve percentage voorspellingstools hoog. De meeste experimentele grootschalige benaderingen zijn gebaseerd op de co-zuivering van sRNA:mRNA-paren die interageren met een gelabeld RNA-bindend eiwit (RBP)6,9. De RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) methode identificeerde bijvoorbeeld RNA duplexen die samen met RNA-chaperonnes zoals Hfq en ProQ werden gezuiverd in Escherichia coli10,11. Een vergelijkbare technologie genaamd UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) werd toegepast op RNase E- en Hfq-geassocieerde sRNAs in E. coli12,13. Ondanks de goed beschreven rollen van Hfq en ProQ in sRNA-gemedieerde regulatie bij meervoudige bacteriën8,14,15, lijkt sRNA-gebaseerde regulatie RNA-chaperonne-onafhankelijk te zijn in verschillende organismen zoals S. aureus16,17,18. Zelfs als de zuivering van RNA-duplexen in combinatie met RNases haalbaar is, zoals aangetoond door Waters en collega’s13,blijft dit lastig omdat RNases hun snelle afbraak veroorzaken. Daarom vormt de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) benadering19,20 een solide alternatief in dergelijke organismen.
In tegenstelling tot bovengenoemde methoden gebruikt MAPS een specifieke sRNA als lokaas om alle interacterende RNA’s vast te leggen en vertrouwt daarom niet op de betrokkenheid van een RBP. Het hele proces is weergegeven in figuur 1. Kortom, de sRNA wordt op de 5′ getagd met de MS2 RNA aptamer die specifiek wordt herkend door het MS2 coat eiwit. Dit eiwit wordt gefuseerd met het maltosebindende eiwit (MBP) dat geïmmobiliseerd moet worden op een amylosehars. Daarom blijven MS2-sRNA en haar RNA-partners behouden op de kolom affiniteitschromatografie. Na elutie met maltose worden co-gezuiverde RNA’s geïdentificeerd met behulp van RNA-sequencing met hoge doorvoer, gevolgd door bio-informatische analyse (figuur 2). De MAPS-technologie tekent uiteindelijk een interacterende kaart van alle mogelijke interacties die in vivo plaatsvinden.
MAPS-technologie werd oorspronkelijk geïmplementeerd in de niet-pathogene gramnegatieve bacterie E. coli21. Opmerkelijk genoeg hielp MAPS bij het identificeren van een tRNA-afgeleid fragment dat specifiek interageert met zowel RyhB- als RybB-sRNAs en het voorkomen van sRNA-transcriptieruis om mRNA-doelen te reguleren in niet-inducerende omstandigheden. Daarna is MAPS met succes toegepast op andere E. coli sRNAs zoals DsrA22, RprA23, CyaR23 en GcvB24 (Tabel 1). Naast het bevestigen van eerder bekende doelen, breidde MAPS het targetome van deze bekende sRNAs uit. Onlangs is MAPS uitgevoerd in Salmonella Typhimurium en onthulde dat SraL sRNA bindt aan rho mRNA, codering voor een transcriptie beëindiging factor25. Door deze koppeling beschermt SraL rho mRNA tegen de voortijdige transcriptie-beëindiging die door Rho zelf wordt geactiveerd. Interessant is dat deze technologie niet beperkt is tot sRNAs en kan worden toegepast op elk type cellulaire RNA’s, zoals blijkt uit het gebruik van een tRNA-afgeleid fragment26 en een 5′-onvertaald gebied van mRNA22 (Tabel 1).
Maps methode is ook aangepast aan de pathogene Gram-positieve bacterie S. aureus19. In het bijzonder is het lysisprotocol op grote schaal aangepast om cellen efficiënt te breken als gevolg van een dikkere celwand dan gramnegatieve bacteriën en om de RNA-integriteit te behouden. Dit aangepaste protocol ontrafelde reeds het interactoom van RsaA27, RsaI28 en RsaC29. Deze aanpak gaf inzicht in de cruciale rol van deze sRNAs in regulerende mechanismen van celoppervlakeigenschappen, glucoseopname en oxidatieve stressreacties.
Het protocol dat in 2015 in E. coli is ontwikkeld en geïmplementeerd, is onlangs uitvoerig beschreven30. Hier bieden we het aangepaste MAPS-protocol, dat bijzonder geschikt is voor het bestuderen van sRNA-regulerende netwerken in Gram-positieve (dikkere celwand) bacteriën, of ze nu niet-pathogeen of pathogeen zijn (veiligheidsmaatregelen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Een aangepast protocol voor Gram-positieve bacteriën
Het initiële protocol van MAPS werd ontwikkeld om sRNA interactoom te bestuderen in het modelorganisme E. coli20,30. Hier beschrijven we een aangepast protocol dat geschikt is voor de karakterisering van sRNA-afhankelijke regulerende netwerken in de opportunistische menselijke pathogene S. aureus en zeker kan worden omgezet naar andere grampositieve bacteriën, pathogeen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, en ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, aan PR). Het is ook gepubliceerd in het kader van de labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 en van ANR-17-EURE- 0023 (naar PR), als financiering van de staat beheerd door ANR als onderdeel van de investeringen voor het toekomstige programma. DL werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement nr. 753137-SaRNAReg. Het werk in E. Massé Lab is ondersteund door exploitatiesubsidies van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
