Summary

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Published: February 23, 2021
doi:

Summary

La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L’sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell’RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.

Abstract

Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l’obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l’aptamero MS2 è fuso all’estremità 5 ‘ dell’sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all’MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L’estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l’acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l’eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell’RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell’agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un’istantanea dell’intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.

Introduction

Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell’adattamento agli ambientifluttuanti1,2,3. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l’accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l’avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione allatraduzione 4. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell’mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.

La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l’intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l’identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull’accoppiamento dell’energia e sull’accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l’accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones8 favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall’RNA in diversi organismi come S. aureus16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi13, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l’approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.

A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L’intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l’sRNA viene taggato a 5′ con l’aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l’eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell’RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.

La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli21. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione25. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall’uso di un frammento derivato da tRNA26 e di una regione non tradotta di 5’di mRNA22 (Tabella 1).

Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus19. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l’integrità dell’RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l’interactome di RsaA27,RsaI28 e RsaC29. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell’assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.

Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio30. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).

Protocol

1. Buffer e supporti Per gli esperimenti MAPS, preparare i seguenti buffer e supporti:- Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)- Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Tritone, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)- Tampone di carico dell’RNA (0,025% cianolo di xilene e 0,025% blu bromofenolo in urea 8 M)- Mezzo per infusione di cuore cerebrale (BHI) (12,5 g di cervello di vitello, 10 g di peptone, 5 g di cuore di manzo…

Representative Results

I risultati rappresentativi derivano dallo studio del targetome RsaC in S. aureus29. RsaC è uno sRNA non convenzionale lungo 1.116 nt. La sua estremità di 5′ contiene diverse regioni ripetute mentre la sua estremità di 3 ‘ (544 nt) è strutturalmente indipendente e contiene tutti i siti di interazione previsti con i suoi obiettivi di mRNA. L’espressione di questo sRNA è indotta quando il manganese (Mn) è scarso, che si incontra spesso nel contesto della risposta immunitaria dell’ospi…

Discussion

Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi
Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l’interactoma dello sRNA nell’organismo modello E. coli20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall’sRNA nell’opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.

<p …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH e ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). È stato anche pubblicato nell’ambito del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e di ANR-17-EURE- 0023 (a PR), come finanziamento dallo Stato gestito da ANR nell’ambito degli investimenti per il futuro programma. DL è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 753137-SaRNAReg. Il lavoro in E. Massé Lab è stato supportato da sovvenzioni operative del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e del National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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