Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell’adattamento agli ambienti^{fluttuanti1,2,3}. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l’accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l’avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione alla^{traduzione 4}. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell’mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.

La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l’intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l’identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA^5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull’accoppiamento dell’energia e sull’accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l’accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones⁸ favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)^6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli^10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli^12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri^8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall’RNA in diversi organismi come S. aureus^16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi¹³, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l’approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)^19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.

A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L’intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l’sRNA viene taggato a 5′ con l’aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l’eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell’RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.

La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli²¹. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA²², RprA²³, CyaR²³ e GcvB²⁴ (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione²⁵. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall’uso di un frammento derivato da tRNA²⁶ e di una regione non tradotta di 5’di mRNA²² (Tabella 1).

Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus¹⁹. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l’integrità dell’RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l’interactome di RsaA^27,RsaI²⁸ e RsaC²⁹. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell’assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.

Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio³⁰. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).