בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.
Abstract
פני העין נחשבו בעבר מיוחסים חיסוניים ואביוטיים, אך לאחרונה נראה כי קיימת נוכחות קומית קטנה אך מתמשכת. זיהוי וניטור של מיני חיידקים ברירית העין היו מאתגרים בשל השפע הנמוך שלהם וזמינות מוגבלת של מתודולוגיה מתאימה לצמיחה וזיהוי commensal. ישנן שתי גישות סטנדרטיות: שיטות מבוססות תרבות או רצף DNA. השיטה הראשונה בעייתית בשל החיידקים המוגבלים הניתנים לשחזור והגישה השנייה מזהה חיידקים חיים ומתים המובילים לייצוג חריג של מרחב העין. פיתחנו שיטה חזקה ורגישה לבידוד חיידקים על ידי בנייה על טכניקות פולחן מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. זוהי טכניקה מבוססת ספוגית, תוך שימוש ב”מעבדה” העשויה ספוגית דקה המכוונת ללחמית התחתונה, ואחריה צעד הגברה עבור סוגים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים. פרוטוקול זה אפשר לנו לבודד ולזהות מינים הלחמית כגון קורינבקטריום spp., קוגולאז סטפילוקוקוס שלילי spp., סטרפטוקוקוס spp., וכו ‘. הגישה מתאימה להגדרת גיוון קומנסלי בעכברים בתנאי מחלה שונים.
Introduction
מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את הבידוד הספציפי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים בני קיימא ונדירים מהלחמית העין כדי לאפיין את המיקרוביום העין. מחקרים מקיפים פרופיל קהילות הרירית commensal על העור, המעיים, דרכי הנשימה ואברי המין ולהראות כי קהילות אלה משפיעים על התפתחות המערכת החיסונית ואת התגובה1,2,3. קהילות עיניים הוכחו להשתנות במהלך פתולוגיות מחלה מסוימות, כגון מחלת עיניים יבשות4, תסמונת סיוגרן5 וסוכרת6. עם זאת, היכולת להגדיר קהילה טיפוסית של משטח עיני מעוכבת על ידי השפע הנמוך יחסית שלהם בהשוואה לאתרי הרירית האחרים6,7,8. זה מעורר מחלוקת אם יש מיקרוביום עיני תושב ואם הוא קיים, אם זה שונה מיקרוביום העור וכתוצאה מכך, ההשפעה המקומית שלה על התפתחות מערכת החיסון המולדת ותגובה. פרוטוקול זה יכול לסייע בפתרון שאלה זו.
בדרך כלל, גישות להגדרת הנישה העין commensal מבוססים על רצף וטכניקות מבוססות תרבות4,7,9. ריצוף 16 S rDNA וניתוח BRISK7 מראים מגוון רחב יותר מאשר טכניקות מבוססות תרבות, אך אינם מסוגלים להבחין בין מיקרואורגניזמים חיים למתים. מכיוון שפני השטח העין עוינים למיקרואורגניזמים רבים בשל תכונות אנטי-מיקרוביאליות של סרט דמעה4 היוצרים מגוון גדול של שברי דנ”א, גישות מבוססות DNA יזהו את הממצאים הללו אשר עשויים להטות את הנתונים לזיהוי חיידקים מתים כחיידקים מקומיים ולא כמזהמים. התוצאה היא זיהוי ואפיון חריגים של מרחב העין כ גבוה יותר בשפע החיידקים ובמגוון10. זה מקשה להגדיר את המיקרוביום העין תושב באמצעות שיטות מבוססות DNA. בעוד, טכניקות סטנדרטיות המבוססות על תרבות אינן מסוגלות לזהות commensals כי העומס הוא נמוך מדי11. השיטה שלנו משפרת על פרקטיקות סטנדרטיות באמצעות ספוגית דקה שיכולה למקד את הלחמית, ובכך למנוע זיהום מעור שכן, כמו גם את הרעיון כי אורגניזמים קיימא יכולים להיות מועשרים על ידי תרבות קצרה בתקשורת צפופה מיזינים במטרה להחיות קיימא אך לא culturable, כמו גם, העשרה עבור מיקרואורגניזמים קיימא נדירים.
התוצאות, שפע יחסי של קומנסלים עיניים לכל ספוגית עיניים, מאפיינות את המיקרוביום תושב הלחמית והן חשובות למטרות השוואתיות. הנתונים שלנו מראים כי יש הבדל בין עור מיקרוביוטה הלחמית, כמו גם מגוון גדול יותר עם גיל מוגבר הבדל ספציפי למין בשפע. יתר על כן, גישה זו מצאה באופן שכפול הבדלים commensal בעכברים בנוקאאוט12. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לתאר את המיקרוביום העין אשר עשוי להשתנות עקב שיטות caging, גיאוגרפיה, או מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות המקומיות של מטבוליטים commensal ומוצרים על התפתחות המערכת החיסונית ותגובה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל המצב paucibacterial של פני השטח העין, מעבדות רבות התקשו לבודד commensals עינית7,20, וכתוצאה מכך מספר נמוך של דגימות עם צמיחה, שפע נמוך ומגוון נמוך8. שיטה זו משפרת באופן משמעותי על פרקטיקות תרבות סטנדרטיות4,21 על ידי תוספת של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון P30 DK034854 נתמך VY, LB ומחקרים במרכז המארח-מיקרוביום של מסצ’וסטס ומימון מ NIH / NEI R01 EY022054 נתמך MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
