Summary

Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

Published: May 01, 2021
doi:

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.

Abstract

Die Augenoberfläche galt einst als immunprivilegiert und abiotisch, aber in letzter Zeit scheint es, dass es eine kleine, aber anhaltende kommensale Präsenz gibt. Die Identifizierung und Überwachung von Bakterienarten an der Augenschleimhaut war aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der begrenzten Verfügbarkeit geeigneter Methoden für das kommensale Wachstum und die Identifizierung eine Herausforderung. Es gibt zwei Standardansätze: kulturbasierte oder DNA-Sequenzierungsmethoden. Die erste Methode ist aufgrund der begrenzten rückgewinnbaren Bakterien problematisch und der zweite Ansatz identifiziert sowohl lebende als auch tote Bakterien, was zu einer abweichenden Darstellung des Augenraums führt. Wir haben eine robuste und empfindliche Methode zur Bakterienisolierung entwickelt, indem wir auf mikrobiologischen Standardkulturtechniken aufbauen. Dies ist eine auf Tupfern basierende Technik, bei der ein “im Labor” hergestellter dünner Tupfer verwendet wird, der auf die untere Bindehaut abzielt, gefolgt von einem Amplifikationsschritt für aerobe und fakultative anaerobe Gattungen. Dieses Protokoll hat es uns ermöglicht, Bindehautarten wie Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. usw.zu isolieren und zu identifizieren. Der Ansatz eignet sich, um die kommmensale Diversität bei Mäusen unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu definieren.

Introduction

Ziel dieses Protokolls ist es, die spezifische Isolierung lebensfähiger und seltener aerober und fakultativer anaerober Mikroben aus der okulären Bindehaut zu verbessern, um das okuläre Mikrobiom zu charakterisieren. Umfangreiche Studien haben kommensale Schleimhautgemeinschaften auf Haut, Darm, Atemwegen und Genitaltrakt profiliert und zeigen, dass diese Gemeinschaften die Entwicklung des Immunsystems und die Reaktion beeinflussen1,2,3. Es wurde gezeigt, dass sich okuläre Kommensalgemeinschaften während bestimmter Krankheitspathologien wie der Erkrankung des trockenen Auges4, des Sjögren-Syndroms5 und des Diabetes6verändern. Die Fähigkeit, eine typische kommensale Gemeinschaft an der Augenoberfläche zu definieren, wird jedoch durch ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu den anderenSchleimhautstellen behindert 6,7,8. Dies löst eine Kontroverse darüber aus, ob es ein residentes Augenmikrobiom gibt und ob es existiert, ob es sich vom Hautmikrobiom und folglich seiner lokalen Wirkung auf die Entwicklung und Reaktion des angeborenen Immunsystems unterscheidet. Dieses Protokoll kann helfen, diese Frage zu lösen.

Im Allgemeinen basieren Ansätze zur Definition der okulären kommensalen Nische auf Sequenzierung und kulturbasierten Techniken4,7,9. 16 S rDNA-Sequenzierung und BRISK-Analyse7 zeigen eine größere Vielfalt als kulturbasierte Techniken, sind aber nicht in der Lage, zwischen lebenden und toten Mikroben zu unterscheiden. Da die Augenoberfläche für viele Mikroben aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften des Tränenfilms 4 feindlichist, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten erzeugen, werden DNA-basierte Ansätze diese Artefakte erkennen, die die Daten zur Identifizierung toter Bakterien als ansässige Kommensale und nicht als Verunreinigungen verzerren können. Dies führt zu einer abweichenden kommensalen Identifizierung und Charakterisierung des Augenraums als höher in Mikrobenhäufigkeit und Diversität10. Dies macht es schwierig, das ansässige okuläre Mikrobiom mit DNA-basierten Methoden zu definieren. Während Standardkulturbasierte Techniken keine Kommensalen erkennen können, weil die Last zu niedrig ist11. Unsere Methode verbessert die Standardpraktiken, indem sie einen dünnen Tupfer verwendet, der auf die Bindehaut abzielen kann, wodurch eine Kontamination durch benachbarte Haut vermieden wird, sowie das Konzept, dass lebensfähige Organismen durch kurze Kultur in nährstoffreichen Medien angereichert werden können, mit dem Ziel, lebensfähige, aber nicht kultivierbare, sowie die Anreicherung seltener lebensfähiger Mikroben wiederzubeleben.

Die Ergebnisse, relative Häufigkeit von okulären Kommensalen pro Augenabstrich, charakterisieren das Bindehaut-residente Mikrobiom und sind für Vergleichszwecke wichtig. Unsere Daten zeigen, dass es einen Unterschied zwischen Haut und Bindehautmikrobiota sowie eine größere Vielfalt mit zunehmendem Alter und einem geschlechtsspezifischen Unterschied in der Fülle gibt. Darüber hinaus hat dieser Ansatz reproduzierbar kommsale Unterschiede bei Knock-out-Mäusengefunden 12. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das okuläre Mikrobiom zu beschreiben, das aufgrund von Käfigpraktiken, Geografie oder Krankheitszustand variieren kann, sowie die lokalen Auswirkungen von kommensalen Metaboliten und Produkten auf die Entwicklung und Reaktion des Immunsystems.

Protocol

Alle Verfahren mit Mäusen folgen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Befolgen Sie die Laborsicherheitsrichtlinien (gemäß den Anweisungen Ihrer Abteilung für umweltbedingte Gesundheit und Sicherheit), wenn Sie mit Mikroorganismen und potenziell kontaminierten Materialien arbeiten. Verwenden Sie geeignete Abfallbehälter und Dekontaminationsverfahren, bevor Sie potenziell biologisch kontaminationsgefährdete Materialien entsorgen. 1. Vorbereitung des Augenabstrichs…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse für eine Augenabstrichplatte, die verschiedene Methoden zur Beschichtung demonstriert, sind in Abbildung 3A dargestellt, die morphologisch unterschiedliche Isolate von C57BL/6-Maus zeigt. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit, einzigartige Colony Forming Units (CFUs) pro Augenabstrich, berechnet und zu Vergleichszwecken aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzeln…

Discussion

Aufgrund des paucibakteriellen Zustands der Augenoberfläche hatten viele Labore Schwierigkeiten, die okulären Kommensalen7,20zuisolieren, was zu einer geringen Anzahl von Proben mit Wachstum, geringer Häufigkeit und geringer Diversitätführte 8. Diese Methode verbessert die Standardkulturpraktiken4,21 erheblich durch die Hinzufügung eines Anreicherungsschritts sowie eines neu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung von P30 DK034854 unterstützte VY, LB und Studien im Massachusetts Host-Microbiome Center und die Finanzierung von NIH / NEI R01 EY022054 unterstützte MG.

Materials

0.1 to 10 µl pipet tip USA Scientific 1110-300 autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet Fisher Scientific 13-690-026
1 ml syringe Fisher Scientific BD309623 1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 autoclave before use
1000 µ ml pipet tip USA Scientific 1111-2021 autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) Fisher Scientific F123602G
25 G needle Fisher Scientific 14-826AA 1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide Fisher Scientific S25359
37 ° C Incubator Lab equipment
70 % Isopropanol Fisher Scientific PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) Santa Cruz Animal Health SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit Fisher Scientific B12539
Bunsen Burner Lab equipment
Clean paper towels Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton CVS
Disposable 1 ml Pipets Fisher Scientific 13-711-9AM for Gram stain and catalase tests
E.coli ATTC ATCC 8739
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml) Henry Schein 9950001
Mac Conkey Agar Plates Fisher Scientific 4321270 store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar Carolina Biological Supply 784641 Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice Jackson Labs C57/BL6J
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12 for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media Fisher Scientific 50-488525 prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) EMD/Millipore, Fisher Scientifc SCGP00525 to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube Fisher Scientific 430829 anesthesia preparation
Sterile mouse cage Lab equipment
Tooth picks (round bamboo) Kitchen Essentials autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates Fisher Scientific 4321261 store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution BioMerieux Inc. Durham, NC 411071
Single use eye drops CVS Pharmacy Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each

References

  1. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
  3. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
  4. Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
  5. Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
  6. Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
  7. Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
  8. Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
  9. Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
  10. Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
  11. Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
  12. Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
  13. Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
  14. Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
  15. UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
  16. Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
  17. Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
  18. Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
  19. Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
  20. Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
  21. Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
  22. Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
  23. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
  24. Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
  25. Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
  26. Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
  27. Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
  28. Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
  29. Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
  30. Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
  31. Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
  32. Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
  33. Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
  34. Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).

Play Video

Cite This Article
Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin, T., Delaney, M., Bry, L., Gadjeva, M. Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice. J. Vis. Exp. (171), e61672, doi:10.3791/61672 (2021).

View Video