Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi

Lo scopo di questo protocollo è quello di migliorare l’isolamento specifico di microbi anaerobici aerobici e facultativi vitali e rari dalla congiuntiva oculare per caratterizzare il microbioma oculare. Studi approfonditi hanno profilato le comunità mucose commenali sulla pelle, l’intestino, le vie respiratorie e genitali e mostrano che queste comunità influenzano lo sviluppo del sistema immunitario^{e la risposta 1,2,3}. Le comunità commenali oculari hanno dimostrato di cambiare durante alcune patologie della malattia, come la malattia dell’occhio^{secco 4,}la sindrome di Sjogren⁵ e il diabete⁶. Tuttavia, la capacità di definire una tipica comunità commensale di superficie oculare è ostacolata dalla loro abbondanza relativamente bassa rispetto agli altri siti di^{mucosa 6,7,8}. Ciò suscita una controversia sul fatto che esista un microbioma oculare residente e se esiste, se differisce dal microbioma cutaneo e, di conseguenza, il suo effetto locale sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario innato. Questo protocollo può aiutare a risolvere questa domanda.

Generalmente, gli approcci per definire la nicchia commensal oculare si basano sul sequenziamento e sulle tecniche^{basate sulla cultura 4,7,9}. 16 Il sequenziamento s rDNA e l’analisi BRISK^{7 mostrano} una diversità più ampia rispetto alle tecniche basate sulla cultura, ma non sono in grado di distinguere tra microbi vivi e morti. Poiché la superficie oculare è ostile a molti microbi a causa delle proprietà antimicrobiche⁴ del film lacrimale che generano una vasta gamma di frammenti di DNA, gli approcci basati sul DNA rileveranno questi artefatti che possono distorcere i dati verso l’identificazione di batteri morti come commensal residenti piuttosto che contaminanti. Ciò si traduce in un’identificazione commensale aberrante e nella caratterizzazione dello spazio oculare come più elevato nell’abbondanza e nella diversità dei microbi¹⁰. Ciò rende difficile definire il microbioma oculare residente tramite metodi basati sul DNA. Considerando che le tecniche standard basate sulle impostazioni cultura non sono in grado di rilevare commensals perché il carico è^{troppo basso 11}. Il nostro metodo migliora le pratiche standard utilizzando un tampone sottile in grado di colpire la congiuntiva, evitando così la contaminazione dalla pelle vicina, così come il concetto che gli organismi vitali possono essere arricchiti da una breve coltura in mezzi densi di nutrienti con l’obiettivo di rianimare vitale ma non culturabile, oltre che arricchente per rari microbi vitali.

I risultati, l’abbondanza relativa di commensali oculari per tampone oculare, caratterizzano il microbioma residente congiuntiva e sono importanti per scopi comparativi. I nostri dati mostrano che c’è una differenza tra pelle e microbiota congiuntivale, così come una maggiore diversità con l’aumento dell’età e una differenza di abbondanza specifica per sesso. Inoltre, questo approccio ha trovato riproducibilmente differenze commenali nei topi knock-out¹². Questo protocollo può essere applicato per descrivere il microbioma oculare che può variare a causa di pratiche di permanenza in gabbia, geografia o stato di malattia, così come gli effetti locali dei metaboliti commensali e dei prodotti sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario.