Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.
Abstract
Het oculaire oppervlak werd ooit beschouwd als immuun bevoorrecht en abiotisch, maar onlangs lijkt het erop dat er een kleine, maar aanhoudende commensale aanwezigheid is. De identificatie en monitoring van bacteriële soorten in het oogslijmvlies waren een uitdaging vanwege hun geringe overvloed en beperkte beschikbaarheid van geschikte methodologie voor commensale groei en identificatie. Er zijn twee standaardbenaderingen: op cultuur gebaseerde of DNA-sequencingmethoden. De eerste methode is problematisch vanwege de beperkte herwinbare bacteriën en de tweede benadering identificeert zowel levende als dode bacteriën die leiden tot een afwijkende weergave van de oculaire ruimte. We ontwikkelden een robuuste en gevoelige methode voor bacteriële isolatie door voort te bouwen op standaard microbiologische kweektechnieken. Dit is een op uitstrijkjes gebaseerde techniek, met behulp van een “in-lab” gemaakt dun wattenstaafje dat zich richt op het onderste bindvlies, gevolgd door een versterkingsstap voor aerobe en facultatieve anaerobe geslachten. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om conjunctivale soorten zoals Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., enz. te isoleren en te identificeren. De aanpak is geschikt om commensale diversiteit bij muizen onder verschillende ziekteomstandigheden te definiëren.
Introduction
Het doel van dit protocol is om de specifieke isolatie van levensvatbare en zeldzame aerobe en facultatieve anaerobe microben uit het oculaire bindvlies te verbeteren om het oculaire microbioom te karakteriseren. Uitgebreide studies hebben commensale mucosale gemeenschappen geprofileerd op de huid, darmen, luchtwegen en geslachtsorganen en tonen aan dat deze gemeenschappen de ontwikkeling van het immuunsysteem en de respons1,2,3beïnvloeden . Van oculaire commensale gemeenschappen is aangetoond dat ze veranderen tijdens bepaalde ziektepathologieën, zoals droge ogenziekte4,syndroom van Sjogren5 en diabetes6. Toch wordt het vermogen om een typische oculaire oppervlaktecommensale gemeenschap te definiëren belemmerd door hun relatief lage overvloed in vergelijking met de andere mucosale sites6,7,8. Dit leidt tot een controverse over de vraag of er een ingezeten oculaire microbioom is en of het bestaat, of het verschilt van het huidmicrobioom en bijgevolg het lokale effect ervan op de ontwikkeling en reactie van het aangeboren immuunsysteem. Dit protocol kan helpen deze vraag op te lossen.
Over het algemeen zijn benaderingen om de oculaire commensale niche te definiëren gebaseerd op sequencing en op cultuur gebaseerde technieken4,7,9. S rDNA-sequencing en BRISK-analyse7 vertonen een bredere diversiteit dan op cultuur gebaseerde technieken, maar kunnen geen onderscheid maken tussen levende en dode microben. Omdat het oculaire oppervlak vijandig is voor veel microben als gevolg van de antimicrobiële eigenschappen van traanfilm4 die een grote reeks DNA-fragmenten genereren, zullen DNA-gebaseerde benaderingen deze artefacten detecteren die de gegevens kunnen scheeftrekken in de richting van identificatie van dode bacteriën als ingezeten commensalen in plaats van verontreinigingen. Dit resulteert in afwijkende commensale identificatie en karakterisering van de oculaire ruimte als hoger in microbenrijkdom en diversiteit10. Dit maakt het moeilijk om het ingezeten oculaire microbioom te definiëren via DNA-gebaseerde methoden. Overwegende dat standaard kweekgebaseerde technieken geen commensalen kunnen detecteren omdat de belasting te laag is11. Onze methode verbetert de standaardpraktijken door een dun wattenstaafje te gebruiken dat zich op het bindvlies kan richten, waardoor besmetting van de naburige huid wordt vermeden, evenals het concept dat levensvatbare organismen kunnen worden verrijkt door een korte cultuur in voedingsrijke media met als doel levensvatbare maar niet-cultureerbare, evenals verrijking voor zeldzame levensvatbare microben te reanimeren.
De resultaten, relatieve overvloed aan oculaire commensalen per oogdoekje, karakteriseren het conjunctiva resident microbioom en zijn belangrijk voor vergelijkende doeleinden. Onze gegevens tonen aan dat er een verschil is tussen huid en conjunctivale microbiota, evenals een grotere diversiteit met verhoogde leeftijd en een geslachtsspecifiek verschil in overvloed. Bovendien heeft deze aanpak reproduceerbaar commensale verschillen gevonden in knock-out muizen12. Dit protocol kan worden toegepast om het oculaire microbioom te beschrijven dat kan variëren als gevolg van kooipraktijken, geografie of ziektetoestand, evenals de lokale effecten van commensale metabolieten en producten op de ontwikkeling en respons van het immuunsysteem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de paucibacteriële toestand van het oculaire oppervlak hebben veel laboratoria moeite gehad met het isoleren van oculaire commensalen7,20, wat resulteerde in een laag aantal monsters met groei, lage overvloed en lage diversiteit8. Deze methode verbetert de standaard kweekpraktijken4,21 aanzienlijk door de toevoeging van een verrijkingsstap, evenals een opnieuw ontworpen oo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering van P30 DK034854 ondersteunde VY, LB en studies in het Massachusetts Host-Microbiome Center en financiering van NIH / NEI R01 EY022054 ondersteunde MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
