במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר
Summary
אנו מתארים את ההליכים לבידוד של גידול oocytes מזקיקי השחלות בשלבים מוקדמים של פיתוח, כמו גם את ההתקנה של מערכת תרבות מבחנה אשר יכול לתמוך בצמיחה ובידול עד לשלב הבוגר במלואו.
Abstract
העתודה המוגבלת של אוציטים בוגרים ותו לא מהווים מחסום מרכזי להצלחת הרבייה בסיוע ליונקים. בהתחשב בכך שבמהלך תוחלת החיים של הרבייה רק כ 1% של oocytes בשחלה בוגרת ומבייצת, מספר טכניקות פותחו כדי להגדיל את הניצול של שמורת השחלות לאוכלוסייה הגדלה של זקיקים שאינם מבייצים. טכנולוגיות כאלה אפשרו התערבויות של שימור פוריות, תוכניות בחירה במשק החי ושימור מינים בסכנת הכחדה. עם זאת, הפוטנציאל העצום של שמורת השחלות עדיין לא נופק ברובו. בפרות, למשל, נעשו כמה ניסיונות לתמוך בתרבות המבחנה של אוציטים בשלבים התפתחותיים ספציפיים, אך פרוטוקולים יעילים ואמינים עדיין לא פותחו. כאן אנו מתארים מערכת תרבות השוחזרת את התנאים הפיזיולוגיים של שלב הזקיקים המתאים, המוגדרת להתפתח במבחנה הגדלה oocytes שנאספו מזקיקי אנטרל מוקדם של צב ים לשלב הבוגר במלואו, המקביל זקיק אנתלי בינוני ב vivo. שילוב של הורמונים ופוספודיסטרז 3 מעכב שימש כדי למנוע חידוש מיוטי בטרם עת כדי להנחות את ההבידול של oocyte.
Introduction
במהלך תוחלת החיים של הרבייה, רק חלק קטן של oocytes הנוכחיים בשחלה בוגרת, משתחררים בחצוצרות בעת הביוץ, והם זמינים להיות מופרית ולפתחלעובר קיימא 1. מצד שני, רוב האוציטים בתוך השחלה עוברים אטרזיה ולעולם לא מביצים. במבחנה עובר ייצור (IVP) טכנולוגיות ניסו להגדיל את הניצול של שמורת השחלות2,,3. עד כה, טכנולוגיות כאלה אפשרו התערבויות של שימור פוריות, תוכניות בחירה במשק החי ושימור מינים בסכנת הכחדה. אף על פי כן, רוב הפרוטוקולים להשתמש oocytes כי בעצם השלימו את שלב הצמיחה בתוך זקיק השחלות antral, ולכן מכונים oocytes גדל במלואו. בבקר, שבו טכנולוגיות IVP נמצאות בשימוש נרחב, oocytes גדל באופן מלא להגיע קוטר סופי של כ 120 μm נאספים זקיקים המשתרעים מ 2 עד 8 מ”מ קוטר (זקיקי אנטרל בינוני)1. עם הבידוד מהזקיקים, אוציטים כאלה הם במבחנה התבגרו ומופריים. הזיגוטים מתהתרבות לאחר מכן עד לשלב blastocyst או מועברים לנמען או cryopreserved. בבקר, כמו גם מינים רבים אחרים, למרות הפוטנציאל המוצע על ידי IVP, מספר העובר המיוצר במבחנה לכל פרה לא השתפר במידה רבה ב-40 השנים האחרונות. זאת בין היתר בשל המספר המוגבל של oocytes גדל באופן מלא המאכלסים שחלה בזמן נתון אשר ניתן לאחזר ולהיות נתון טכניקות IVPסטנדרטיות 4,5,6.
oocytes המוקפים בתוך זקיקי antral מוקדם, כלומר, זקיקים אלה כי הם פחות מ 2 מ”מ קוטר, מייצגים מקור פוטנציאלי לשמש בתוכניות שימור פוריות7 , כמו שחלה בערך מכיל 10 פעמים זקיקים אנטראליים מוקדמים יותר מאשר נמלהבינונית 8. עם זאת, oocytes אלה עדיין בשלב הצמיחה ועדיין לא הגיעו לשלב 9 גדלבמלואו. בתור שכזה, הם עדיין פעילים תעתיק, הפקת mRNAs כי יאוחסן עבור צעדים התפתחותיים מאוחרים יותר, ועדיין לא עברו את כל תהליך הבידול הנדרש כדי לתן את oocytes עם היכולת של באופן ספונטני התחדשות והשלמת meiosis אני פעם בודדתי מת תאזקיקים 10,,11. לכן, הם לא יכולים להיות מוגשים ישירות לפרוטוקולי התבגרות חוץ-חוץ (IVM) סטנדרטיים, אבל הם דורשים תקופה נוספת של תרבות שתאפשר להם להשלים את שלב הצמיחה ולהבדיל כראוי.
המעבר מההגדלה לשלב הבוגר במלואו, אשר בבקר מתרחש כאשר הזקיק מתפתח מהעקבר המוקדם לשלב הנמלי הבינוני, הוא אחד הצעדים הקריטיים במהלך פיתוח oocyte. בבקר ניסו מספר מחקרים לסיכום אירועים אלהבמבחנה 2,,12,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19., עם זאת, עד כה לא פותחו פרוטוקולים אמינים ורק דווח על הצלחה מוגבלת. על פי מחקריםקודמים 20, oocytes גדל אלה מהווים אוכלוסייה הומוגנית. מלבד היותם פעילים בתמלול, הכרומטין שלהם מפוזר בפסית הנבט (GV), בתצורה הנקראת GV02,21. לעומת זאת, האוכלוסייה של oocytes גדל באופן מלא המתקבל זקיקי אנטרל בינוני הוא הטרוגני יותר, מצב כי הוא שיקוף על ידי דרגות שונות של דחיסת כרומטין (GV1, GV2 ו GV3) שניתןלצפות 20. בין אלה, נתונים קודמים הראו כי oocytes GV2 ו GV3 מאופיינים באופן כללי באיכות טובה יותר ויכולת התפתחותית עוברית גבוההיותר 20,21,22,23,24.
החל מהתצפיות לעיל, כאן אנו מתארים מערכת תרבות ארוכה של 5 ימים של oocytes (L-IVCO) המאפשרת בידול של oocytes מבודד כמו קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) מזקיקי אנטרל מוקדם. אסטרטגיית תרבות זו התפתחה מ 10 שנים מחקרים ארוכים שנערכו במעבדה שלנו שורשים הקרקע שלה על שפותחו בעבר 24-48 שעות בתרבות oocyte מבחנה (IVCO)2,מערכות טרום בגרות 23,,25 ותוספי אבץ במהלך תרבות oocyte. שילוב של הורמון מגרה זקיק (FSH) ו פוספודאסטראז-3 (PDE3) מעכב, מסוגל לשפר את התקשורת cumulus-oocyte2,למנוע חידוש מיוטיבטרם עת 2, ותמיכהצמיחה oocyte2 שימש.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים מערכת תרבות לגידול oocytes המקדמת פיתוח oocyte במשך 5 ימים על ידי תמיכה בכדאיות שלהם ומניעת חידוש מיוטי. היבט זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לאפשר את המשך הצמיחה והבידול הדרושים כדי לחולץ את האוציט עם יכולת התפתחותית מיוטיתועוברית 2,,20, שאחרת היה נחסם ע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 ו- UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
