Stratégie de culture in vitro pour les ovocytes du follicule antral précoce chez les bovins

Au cours de la durée de vie reproductive, seule une fraction minimale des ovocytes qui sont présents dans un ovaire mature, sont libérés dans les trompes de Fallope lors de l’ovulation, et sont disponibles pour être fécondés et se développer en un embryon viable¹. D’autre part, la plupart des ovocytes dans un ovaire subissent une atrésie et ne sont jamais ovulés. Les technologies de production d’embryons in vitro (IVP) ont tenté d’accroître l’exploitation de la réserve ovarienne^2,3. Jusqu’à présent, ces technologies ont permis des interventions de préservation de la fertilité, de programmes de sélection dans le bétail et de conservation des espèces en voie de disparition. Néanmoins, la plupart des protocoles utilisent des ovocytes qui ont essentiellement terminé la phase de croissance dans le follicule ovarien antral, et sont donc appelés ovocytes adultes. Chez les bovins, où les technologies IVP sont largement utilisées, les ovocytes adultes atteignent un diamètre final d’environ 120 μm et sont prélevés dans des follicules qui s’étendent de 2 à 8 mm de diamètre (follicules antrales moyens)¹. Après l’isolement des follicules, ces ovocytes sont in vitro mûris et fécondés. Les zygotes sont ensuite cultivés jusqu’au stade blastocyste et soit transférés dans un destinataire ou cryoconservés. Chez les bovins, ainsi que chez de nombreuses autres espèces, malgré le potentiel offert par ivp, le nombre d’embryons produits in vitro par vache ne s’est pas largement amélioré au cours des 40 dernières années. Cela est dû en partie au nombre limité d’ovocytes adultes qui peuplent un ovaire à un moment donné qui peut être récupéré et soumis aux techniques STANDARD IVP^4,5,6.

Les ovocytes enfermés dans les follicules antral précoces, c’est-à-dire les follicules de moins de 2 mm de diamètre, représentent une source potentielle à utiliser dans les programmes de préservation de la fertilité⁷ , car un ovaire contient environ 10 fois plus de follicules antral précoces que les antrales moyens⁸. Cependant, ces ovocytes sont encore en phase de croissance et n’ont pas encore atteint le stade⁹. En tant que tels, ils sont encore transcriptionnellement actifs, produisant des ARNms qui seront stockés pour des étapes ultérieures de développement, et n’ont pas encore subi tout le processus de différenciation nécessaire pour conférer les ovocytes avec la capacité de reprendre spontanément et de compléter la méiose I une fois isolé du compartiment folliculaire^10,11. Par conséquent, ils ne peuvent pas être soumis directement aux protocoles standard de maturation in vitro (IVM), mais ils nécessitent une période de culture supplémentaire qui leur permettrait de terminer la phase de croissance et de différencier correctement.

La transition de l’étape de la culture à l’étape adulte, qui chez le bétail se produit lorsque le follicule se développe du stade antral précoce au stade antral moyen, est l’une des étapes critiques du développement des ovocytes. Chez le bétail, plusieurs études ont tenté de récapituler ces événements in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Cependant, à ce jour, aucun protocole fiable n’a été élaboré et seul un succès limité a été signalé. Selon des études précédentes²⁰, ces ovocytes croissants constituent une population homogène. En plus d’être transcriptionnellement actives, leur chromatine est dispersée dans la vésicule germinale (GV), dans une configuration qui s’appelle GV0^2,21. Inversement, la population d’ovocytes adultes obtenus à partir de follicules antral moyens est plus hétérogène, une condition qui se reflète par les différents degrés de compactage de la chromatine (GV1, GV2 et GV3) qui peut être observé²⁰. Parmi ceux-ci, des données antérieures ont montré que les ovocytes GV2 et GV3 sont globalement caractérisés par une meilleure qualité et une meilleure compétence de développement embryonnaire^{20,21,22,23,24}.

À partir des observations ci-dessus, nous décrivons ici un système de culture de 5 jours d’ovocytes (L-IVCO) qui permet la différenciation des ovocytes isolés comme complexes cumulus-oocytes (COC) des follicules antral précoces. Cette stratégie de culture a évolué à partir de 10 ans d’études menées dans notre laboratoire et les racines de son terrain sur les 24-48 heures précédemment développé culture ovocytes (IVCO)², systèmes de prématuration^23,25 et la supplémentation en zinc au cours de la culture des ovocytes . Une combinaison de l’hormone stimulante de follicule (FSH) et d’un inhibiteur de phosphodiestérase-3 (PDE3), capable d’améliorer la communication cumulus-oocyte², empêchent la reprise méiotique intempestive², et soutiennent la croissance d’oocyte² a été employée.