في استراتيجية ثقافة فيترو لبويضات من أوائل الجريب الأنترال في الماشية
Summary
نحن نصف إجراءات عزل البويضات المتنامية من بصيلات المبيض في المراحل المبكرة من التطور ، وكذلك إعداد نظام ثقافة في المختبر يمكن أن يدعم النمو والتمايز حتى المرحلة الكاملة النمو.
Abstract
يمثل الاحتياطي المحدود من البويضات الناضجة القابلة للتخصيب عائقاً رئيسياً أمام نجاح التكاثر المساعد في الثدييات. وبالنظر إلى أنه خلال فترة الحياة الإنجابية فقط حوالي 1٪ من البويضات في المبيض الناضجة والاباضة، وقد تم تطوير العديد من التقنيات لزيادة استغلال احتياطي المبيض لأعداد متزايدة من بصيلات غير مبيضة. وقد سمحت هذه التكنولوجيات بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن الإمكانات الهائلة لاحتياطي المبيض لا تزال غير مستغلة إلى حد كبير. ففي الأبقار، على سبيل المثال، بذلت بعض المحاولات لدعم الثقافة المختبرية للبويضات في مراحل نمو محددة، ولكن لم يتم بعد وضع بروتوكولات فعالة وموثوقة. هنا نحن وصف نظام الثقافة التي تستنسخ الظروف الفسيولوجية للمرحلة المسامية المقابلة، التي تعرف لتطوير في المختبر تزايد البويضات التي تم جمعها من بصيلات الأنطلية الأبقار في وقت مبكر إلى مرحلة نمت بالكامل، المقابلة لبصيلات النمل المتوسطة في الجسم الحي. تم استخدام مزيج من الهرمونات ومثبط phosphodiesterase 3 لمنع استئناف meiotic في وقت غير مناسب وتوجيه التمايز البويض.
Introduction
خلال فترة الحياة الإنجابية، يتم إطلاق جزء ضئيل فقط من البويضات الموجودة في المبيض الناضج، في قناة فالوب عند الإباضة، وتتوفر للتخصبات والتطور إلى جنين قابل للحياة1. من ناحية أخرى، فإن معظم البويضات داخل المبيض تخضع للضجر ولا يتم الإباضة أبداً. في المختبر إنتاج الجنين (IVP) التكنولوجيات قد حاولت زيادة استغلال احتياطي المبيض2,3. وقد سمحت هذه التكنولوجيات حتى الآن بالتدخل في مجال المحافظة على الخصوبة، وبرامج الاختيار في الثروة الحيوانية، وحفظ الأنواع المهددة بالانقراض. ومع ذلك، فإن معظم البروتوكولات تستخدم البويضات التي أكملت أساسا مرحلة النمو داخل بصيلات المبيض الأنتال، وبالتالي يشار إليها على أنها البويضات المزروعة بالكامل. في الماشية، حيث تستخدم تقنيات IVP على نطاق واسع، البويضات المزروعة بالكامل تصل إلى قطرها النهائي من حوالي 120 ميكرومتر ويتم جمعها من بصيلات التي تمتد من 2 إلى 8 ملم في القطر (بصيلات النمل المتوسط)1. عند العزل من بصيلات، والبويضات مثل في المختبر نضجت وتخصيب. ثم يتم استزراع الزيجوت حتى مرحلة الكيسة الأرومية ونقلها إما إلى مستلم أو إلى المبرد. في الماشية، وكذلك في العديد من الأنواع الأخرى، على الرغم من الإمكانات التي تقدمها IVP، لم يتحسن عدد الجنين في المختبر لكل بقرة بشكل كبير على مدى السنوات ال 40 الماضية. ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد المحدود من البويضات المزروعة بالكامل التي تملأ المبيض في وقت معين والتي يمكن استردادها وإخضاعها لتقنيات IVP القياسية4،5،6.
البويضات المغلقة داخل بصيلات النملية المبكرة، أي تلك الجريبات التي تقل عن 2 مم في القطر، تمثل مصدراً محتملاً لاستخدامها في برامج الحفاظ على الخصوبة7 ، كما يحتوي المبيض تقريباً على 10 مرات أكثر من بصيلات الأنترال المبكرة من متوسطة8. ومع ذلك، هذه البويضات لا تزال في مرحلة النمو ولم تصل بعد المرحلة نمت بالكامل9. على هذا النحو، فإنها لا تزال نشطة النسخي، وإنتاج mRNAs التي سيتم تخزينها للخطوات التنموية في وقت لاحق، ولم تخضع بعد كل عملية التمايز المطلوبة لمنح البويضات مع القدرة على استئناف تلقائيا واستكمال meiosis أنا معزولة مرة واحدة من المقصورة الجريبي10،11. ولذلك، لا يمكن تقديمها مباشرة إلى بروتوكولات النضج في المختبر القياسي (IVM)، ولكنها تتطلب فترة إضافية من الثقافة تسمح لهم بإكمال مرحلة النمو والتمييز بشكل صحيح.
الانتقال من مرحلة النمو إلى مرحلة كاملة النمو، والتي تحدث في الماشية عندما يتطور الجريبات من أوائل النمل إلى المرحلة الأنرال المتوسطة، هي واحدة من الخطوات الحاسمة خلال التنمية البويضية. في الماشية، حاولت عدة دراسات لتكبيل هذه الأحداث في المختبر2،12،13،14،15،16،17،18،19. بيد أنه لم يتم حتى الآن وضع بروتوكولات موثوقة ولم يُبلّغ عن سوى نجاح محدود. وفقا للدراسات السابقة20, هذه البويضات المتنامية تشكل سكان متجانس. بالإضافة إلى كونها نشطة بشكل نسخي ، يتم تفريق chromatin في vesicle الجرثومي (GV) ، في تكوين يسمى GV02،21. وعلى العكس من ذلك، فإن عدد البويضات المزروعة بالكامل التي تم الحصول عليها من بصيلات النمل المتوسطة أكثر تجانساً، وهي حالة تعكسها درجات مختلفة من ضغط الكروماتين (GV1 وGV2 وGV3) التي يمكن ملاحظتها20. من بين هذه البيانات السابقة أظهرت أن GV2 وGV3 بويضات تتميز عموما من نوعية أفضل وأعلى كفاءة النمو الجنينية20,21,22,23,24.
بدءا من الملاحظات المذكورة أعلاه، هنا نحن وصف نظام ثقافة طويلة 5 أيام من البويضات (L-IVCO) التي تسمح للتمايز من البويضات معزولة كمجمعات الزلق cumulus-oocyte (COCs) من بصيلات الانطلية المبكرة. وقد تطورت هذه الاستراتيجية ثقافة من 10 سنوات دراسات طويلة أجريت في مختبرنا وجذور أرضها على تطوير سابقا 24-48 ساعة في ثقافة البويضات في المختبر (IVCO)2, نظم الخداج23,,25 والزنك خلال ثقافة البويض. مزيج من هرمون تحفيز بصيلات (FSH) و phosphodiesterase-3 (PDE3) المانع, قادرة على تعزيز cumulus-بويضة الاتصال2, منع استئناف meiotic في وقت غير مناسب2, ودعم نمو البويضات2 تم استخدامها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن وصف نظام ثقافة لزبد البويضات المتنامية التي تعزز التنمية بويضات لمدة 5 أيام من خلال دعم قدرتها على البقاء ومنع استئناف meiotic. هذا الجانب الأخير هو من أهم أهمية للسماح للنمو المستمر والتمايز اللازمة لمنح البويضة مع الكفاءة التنموية meiotic والجنينية2,20, ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 و UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
