Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

La Jolla Alerji ve İmmünoloji Enstitüsü (LJI) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB; IRB protokol no. SGE-121-0714) çalışmayı onayladı. Sağlıklı gönüllüler işe alındı ve yazılı bilgilendirilmiş onaydan sonra lökerez örnekleri sağlandı. 1. Hücre fiksasyonu Hücre süspansiyon konsantrasyonu 15 mL tüpte (<10 mL süspansiyon) veya 50 mL tüpte (10-30 mL hücre) tam hücre kültürü ortamı ile 1 ila 2 x 106 hücre /mL’ye getirin. <1 x 106 hücre, 1,5 mL’lik bir tüpte ortamın 0,5 mL’lik kısmını kullanın. Hücre süspansiyonunu hafifçe girdaplayın, damla yönünde 10x hücre sabitleme tamponu ekleyin (1:10; vol:vol) ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca düşük hızda döndürün. Reaksiyonu hafifçe girdaplayarak durdurun ve 1:20 (vol:vol) oranında 2,5 M glisin ekleyin. Tüpleri birkaç kez ters çevirin ve en az 5 dakika buzda kuluçkaya yatırın. Kalan adımları 4 °C’de veya buzda gerçekleştirin. Tüpleri 4 °C’de 5 dakika boyunca 800 x g’da döndürün ve üst düğmeyi atın. Peleti 5 mL buz gibi 1x PBS ile hafifçe yeniden depolayın ve buzda 2 dakika kuluçkaya yatırın. 1,4 ve 1,5’i 1 mL buz gibi 1x PBS ile tekrarlayın ve numuneyi önceden soğmuş 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın (uzun süreli depolama için etiketlenmiştir). Varsa, aliquots hazırlanması önerilir. Tüpleri 4 °C’de 1.200 x g’da döndürün ve hücre peletini bozmadan süpernatanttan mümkün olduğunca çok çıkarın. Peletin sıvı nitrojenle dondurulmasının ardından. -80 °C’de saklayın.DİkKAT: Sıvı nitrojeni kullanırken uygun korumayı alın. 2. Kromatin kesme NOT: Bu protokol, 0,65 mL düşük bağlayıcı tüplerde 0,3 ila 3 x 106 hücreli peletlerin kromatin kesmesi için optimize edilmiştir. Numune tüpünü -80 °C’den donmuş hücre peletleri ile çıkarın ve lizis tamponu eklemeden önce peletin çözülmesini önlemek için kuru buzda saklayın. Bu adım kritiktir. Pelete 70 μL taze, RT komple liziz tamponu ekleyin ve 1 dakika RT’de tutun. Herhangi bir kabarcık sokmadan peletin 1 dakika boyunca yeniden kullanılabilir ve ardından numuneyi buza koymadan önce hücre süspansiyonunu RT’de 1 dakika kuluçkaya yatırın. Yeniden dirilen peletı 0,65 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın ve buzda tutun.NOT: Tekrarlanabilir sonikasyon elde etmek için, sonicator’u numuneleri sonicating önce 3-6 döngü boyunca sadece boş tüplerle çalıştırarak önceden ısıtın. Numuneleri sonicator’un tüp tutucusuna yerleştirin ve boşlukları 70 μL su ile doldurulmuş denge tüpleriyle doldurun. Sonikasyona başlamadan önce numuneleri yaklaşık 1 dakika su banyosunda bırakın. Döngü başına 16 s ON / 32 s OFF ile x döngüleri için sonication (hücre tipine bağlı olarak) gerçekleştirin.NOT: Bu adım, verimli sonication için en uygun döngü sayısını belirlemek için doğrulama denemeleri gerektirecektir. Her 3 döngüden sonra, numuneleri sonicator’dan çıkarın, yavaşça girdap ve nabız, boruları tutucuya geri koymadan önce döndürün. Kabarcık oluşumuna neden olabileceği için tüpün dışında küçük damlacıklar olmadığından emin olun. Gerekli döngüleri tamamladıktan sonra, numuneleri 4 °C’de 15 dakika boyunca 14.000 x g > döndürün. Süpernatantı yeni, önceden soğutulmuş, düşük bağlayıcı 0,65 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın ve buzda tutun. Sonikasyon verimliliğini kontrol etmek için sonikated örneklerin bir kısmını decrosslink. Süpernatantın 1-7 μL’lik kısmını (yaklaşık 250 ng yamlu kromatin)’i 0,2 mL PCR tüpüne aktarın ve RT’de kısa süreli lizis tamponu ile hacmi 10 μL’ye kadar yapın. 1 μL RNase A ekleyin ve 800 rpm’de 37 °C’de 30 dakika kuluçkaya yaslanın, ardından 1 μL proteinaz K ekleyin. 55 °C’de 2 saat kuluçkaya yaslanın ve 1.000 rpm’de sallanın. Floresan nicelik testi 10 kullanarak DNA nicelemesi için decrosslinked örneğinin2 μL’sini çıkarın (sabun olarak spektrofotometre önerilmez ve bozulmuş protein sonuçlarda önyargı üretebilir). Kalan numuneyi 70 V’ta 1 saat boyunca %1,2 agarose jel üzerinde çalıştırın, nükleik asit boyası (1:20.000) lekesi ve UV transilluminator kullanarak jeli okuyun. Kromatin stok aliquots depolama için hazırlayın (tam lizis tampon ile 20 μL’de 25 ng / μL için numuneyi seyreltin). Tüm yamlu kromatinleri -80 °C’de saklayın. 3. Histone modifikasyonu için otomatik ChIP-Seq NOT: Bu iletişim kuralı chip sıvı işleyicisi üzerinde çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Sistem özelleştirilmiş arabellekler kullanabilse de, tüm arabellekler ChIP kiti ile sağlanır. Bu bölümde kullanılan 8 tüplü ChIP şeritleri ChIP sıvı işleyicisine özgüdir. 500 ng’lik kesme kromatinli 16 örnek aliquot’u -80 °C’den 20 μL’ye aktarın ve kromatinleri yavaşça eritmek için buza yerleştirin. Tamamen çözüldükten sonra, kısa bir süre girdap ve nabız döndürücü. Kromatin hazırlanması Pipet 100 μL tC1 tamponu, iki ChIP 8 tüplü şerit halinde 1x proteaz inhibitörü ve 20 mM sodyum bütirat (komple tC1 tamponu) ile desteklenmiştir. Her kromatin örneğinin 20 μL’sini, 100 μL komple tC1 tamponu içeren ChIP 8 tüplü şeritlerin uygun bir tüpüne aktarın. Kromatin tüplerine 80 μL komple tC1 tampon ekleyerek kromatin tüplerini yıkayın ve ardından 200 μL’lik son hacim için ChIP 8 tüplü şeritlerin uygun tüpüne geri aktarın. Antikorun hazırlanması Antikor hacmini, her tüpte 0,5 μg antikor olacak şekilde hesaplayın.Antikor hacmi = (numune sayısı x reaksiyon başına antikor) / antikor konsantrasyonu Hesaplanan antikor miktarını 500 μL tBW1 tamponuna ekleyin. Hızlı bir şekilde girdap ve nabız döndürme. Pipet 70 μL tBW1 iki ChIP 8 tüplü şeritlerin her birine ve her tüpe 30 μL antikor + tBW1 ekleyin. Bu, tüplerin her birinde toplam hacmi 100 μL’ye getirecektir. Manyetik boncuk hazırlanması Protein A boncuk çözeltisini iyice girdap. 0,5 μg antikor için pipet 5 μL boncuk yeni bir ChIP 8 tüplü şeritler ve darbe dönüşü kümesine. ChIP sıvı işleyicisinin son satırını etiketli, boş ChIP 8 tüplü şeritlerle doldurun. ChIP sıvı işleyici makinesindeki tüm şeritlerin yerleştirilmesi için ChIP-16-IPure-200D program teknik özelliklerini izleyin. Arabellekleri doğru konuma ekleyin, ancak tE1 arabelleği yerine tW4 kullanın.NOT: Günü ChIP sıvı işleyicisinin ChIP’i bir gecede gerçekleştireceği şekilde düzenleyin. Program 16 örnek için yaklaşık 16 saat çalışacaktır. Bu, 1. 4. Kütüphane hazırlığı için kütüphane adaptörlerinin transposaz entegrasyonu Bir termokseri 37 °C ve 500 rpm’ye önceden ayarlayın. Buz üzerinde 0,2 mL tüp şeritleri için bir mıknatısı soğutun. 16 numune için buz üzerinde 440 μL etiketleme tamponu hazırlayın. Pipet 53 μL tek bir yeni 8 tüplü şerit içine ve buz üzerinde tutun. Yeni bir 0,2 mL 8 tüplü şeritte, 220 μL soğuk tC1 tampon ekleyin ve buz üzerinde tutun. 8 şeritli tüpler bu hacmi tutabilir ve hala kaplanabilir. ChIP sıvı işleyici makinesinden (satır 12) “IP örnekleri” şerit tüpünü çıkarın ve darbe eğirme öncesinde tüpleri kaplayın. 2 dakika boyunca 8 tüplü şeritler için mıknatısı kullanarak boncukları yakalayın ve süpernatant’ı dikkatlice çıkarın. Etiketleme tamponunun 25 μL’lik kısmını çok kanallı boncuklara aktarın, mıknatıstan çıkarın ve boncuklar homojen olana kadar hafifçe karıştırın (pipet 20 μL’ye ayarlanmış pipetle yaklaşık 5 kat yukarı ve aşağı). Tüpleri kaplayın ve önceden ısıtılmış termomikserin içine yerleştirin ve 3 dakika kuluçkaya yatırın. Sürenin artırılması kütüphane hazırlığının verimliliğini azaltacaktır. Tüpleri soğutulmuş bir metal rafa aktarın ve her numuneye 100 μL soğutulmuş tC1 tampon ekleyin. Çok kanallı bir pipeti 80 μL’ye ayarlayın ve boncuklar homojen olana kadar numuneyi karıştırın ve etiketleme reaksiyonunu durdurun. Numuneleri ChIP sıvı işleyicisine geri yerleştirin ve yıkama prosedürüne Washing_for_IP reacts_16_Ipuredevam edin. Yıkamanın tC1 tampon ile iki kez ve tW4 ile iki kez gerçekleştirilmesini sağlayın. Elution, arabellek tE1 ile program düzeni tarafından işaretlenmiş olarak tamamlanmalıdır. DNA’nın decrosslinking ChIP sıvı işleyicisinin son satırındaki ChIP 8 tüplü şeritleri çıkarın ve her numuneye 2 μL RNase A ekleyin. Tüpleri kaplayın, nabız döndürün, boncukları karışım homojen olana kadar çok kanallı bir pipetle hafifçe karıştırın ve tüpleri yeniden kaplayın. Numuneleri 37 °C ve 900 rpm’de 30 dakika boyunca bir termomikserde kuluçkaya yatırın. Numuneleri termomikserden çıkarın, 2 μL Proteinaz K ekleyin. Numuneleri bir termomikserde 55 °C ve 1.250 rpm’de 4 saat, ardından bir gecede 1.000 rpm’de 65 °C’ye inkübte edin.NOT: Bu 2. 5. Etiketli DNA parçaları saflaştırma Uygun örnek numarasına sahip on altı adet 1,5 mL tüpü etiketleyin ve DNA temizleme kitinden her birine 400 μL DNA bağlama tamponu ekleyin. Buharlaştırılmış herhangi bir ürünün muhafazasını sağlamak için 8 tüplü şeritleri termokserden çıkarın ve şeritleri nabız döndürün. Boncukları yakalamak için 8 şeritli bir mıknatısa şeritler yerleştirin. 1,5 mL’lik tüplerin her birine 100 μL decrosslinked DNA aktarın. Boncukları yıkamak için 8 tüplü şeritlere 100 μL DNA bağlama tamponu ekleyin ve ardından uygun 1,5 mL tüpe aktarın. Yaklaşık 10 sn için girdap ve 1,5 mL tüpleri nabız döndürün. Sütunları DNA bağlama tamponu ve ChIP örneğini içeren 600 μL ile yükleyin. Örnekleri 10.000 x g’da 20 sn döndürün ve sütunu akışla yeniden yükleyin. Aynı koşullarla tekrar döndürün ve akışı atın. Kolonları 200 μL yıkama tamponu (önceki adımla aynı santrifüj) ile iki kez yıkayın ve akışı atın. Sütunları 12.000 x g’da 2 dakika santrifüjleyarak kurutun. Sütunu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın ve doğrudan sütun matrisine 9 μL sıcak TE Tamponu (önceden 55 °C’ye ısıtılmış) ekleyin. Sütunun santrifüjlemeden önce 1 dakika boyunca 10.000 x g’da1 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. 9 μL’lik eluteyi uygun yeni bir 8 tüplü şerit setine aktarın. Daha önce olduğu gibi 8 μL TE Tampon ile işlemi tekrar tamamlayın. Elute’yi uygun 8 tüplü şeritlere (numune başına son hacim 17 μL) aktarın ve buz üzerinde tutun. 6. Saflaştırılmış numunelerin amplifikasyonu ve boyut seçimi Aşağıdaki adımlar, optimum amplifikasyon için gereken döngü sayısını belirlemek için qPCR kullanır (CtD – Ct tayini) CtD Mix Buffer içeriğini örnek sayısıyla çarparak ctd karışımını tüm numuneler için hazırlayın. 3.6 μL CtD karışımını bir qPCR plakasına dağıtın ve 1.4 μL etiketli DNA örnekleri ekleyin (toplam hacmin ~ % 10’u). Aşağıdaki qPCR’yi gerçekleştirin: 3 dakika için 98 °C, 5 dakika için 72 °C, 30 s için 98 °C, 10 s için 98 °C 26 döngü, 30 s için 63 °C ve 30 s için 72 °C. AMP Mix Buffer içeriğini örnek sayısıyla çarparak Amp Mix’i tüm numuneler için hazırlayın. 14 μL etiketli DNA’yı bir PCR plakasının ayrı kuyularına dağıtın, ardından her numuneye 2,5 μL iki dizin astarı (25 μM) ekleyin (son reaksiyon hacmi 50 μL’dir). Numuneleri çok kanallı pipet ile karıştırın ve CTD’de kullanılan amplifikasyon programını uygun sayıda döngü ile gerçekleştirin.NOT: Güçlendirilmiş numuneler birkaç hafta boyunca -20 °C’de saklanabildiği için bu iyi bir durma noktasıdır. Ancak, saflaştırma aynı gün tamamlanabilir. 48 örnek için, 3 – 6.5 adımları diğer iki ayrı grupla tamamlandı ve daha sonra aşağıda açıklandığı gibi tek bir partide yükseltildi. Aşağıda açıklandığı gibi etiketlenmiş DNA’nın yükseltilme sonrası, boyut seçimi ve nicelemesini gerçekleştirin. Bu genellikle 48 örnekle tamamlanabilir (istenildiği gibi daha az örnekle tamamlanabilir). Her kuyuya 90 μL paramanyetik boncuk (1:1,8 oranı) ekleyin, karıştırın ve RT’de 2 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Bir plaka mıknatısı kullanarak boncukları yakalayın ve süpernatant atın. Boncuk peletini bozmadan boncukları 200 μL taze% 80 etanol ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 20 μL uçlu fazla etanolleri çıkarın ve boncukları 10 dakika boyunca veya boncuk peletlerinde çatlaklar görünene kadar kurumaya bırakın. Plaka hala mıknatıstayken, her kuyuya önceden ısıtılmış suyun 40 μL’sini ekleyin. Plakayı, girdabı iyice kapatın ve plakayı kısa bir süre nabız döndürün. Plakayı mıknatısın üzerine geri yerleştirerek boncukları yakalayın ve 40 μL elute’yi yeni bir “örnek” Plakaya aktarın. Numuneler şimdi saflaştırılmıştır ve sonraki adımlar 200-1.000 bp arasında değişen parçaları zenginleştirir. İsteğe bağlı QC adımı: Numunelerden 4 μL çıkarın ve bir QC plakasına aktarın. Numunelere 4 μL su ekleyin. Bu, büyük parçaların yüzdesini belirler. Örneklere 22 μL paramanyetik boncuk (1:0,55 oranı) ekleyin, dikkatlice karıştırın ve RT’de 2 dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları 5 dakika boyunca yakalamak için mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatantları “örnek” plakanın 7-12 kolonlarına aktarın. Plakayı mıknatıstan çıkarın ve 30 μL boncuk ekleyin (son oran 1:1.3). Dikkatlice karıştırın ve RT’de 2 dakika oturmasına izin verin. Boncukları 5 dakika boyunca yakalayın ve ardından süpernatant atın. Tüm boncukları daha önce açıklandığı gibi 200 μL taze % 80 etanol ile 3 kez yıkayın (adım 6.6.2 – 6.6.3). Peletler kurudıktan sonra, mıknatıs üzerindeyken her kuyuya 8 μL önceden ısıtılmış TE tamponu ile DNA elute edin. Plakayı mıknatıstan, mühürden ve girdaptan iyice çıkarın. Plakanın RT’de 2 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, nabız döndürün ve plakayı 2 dakika boyunca mıknatısın üzerine geri yerleştirin. Süpernatant’ı yeni bir tabağa aktarın (Plaka 2). Maksimum geri kazanım için, ekstra 8 μL önceden ısıtılmış TE tamponu ile tekrarlayın. Örnekleri, her numunenin 16 μL son kütüphaneye sahip olacak şekilde uygun kuyulara yerleştirin.NOT: Bu adımın sonunda iki plaka olmalıdır (QC plakası tamamlanmışsa bir tane). QC plakası önceden seçilmiş parçalara sahip olacak ve ikinci plaka 48 kuyu final kütüphanesine sahip olmalıdır (toplam 16 μL). 7. Floresan tahlili kullanarak nihai kütüphaneleri ve QC örneklerini ölçün Floresan nicel test veya benzer bir yöntem kullanarak tam DNA nicelemesi. QC nicelemesi tamamlandıysa, 1.000 bp'< olan numune kaybının yüzdesini belirleyin. Yaklaşık% 20'den fazla kayıp olmamalıdır – daha fazlası varsa, uygulanan boncuk oranlarıyla ilgili bir sorun olabilir. Tercihen bir kılcal elektroforez makinesi kullanarak her numunenin parçalarının boyutunu belirleyin. Molar konsantrasyonu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: [Kütüphane konsantrasyonu (ng/μL) * 106]/[660 * Ortanca parça boyutu (bp)].NOT: Kitaplıklar, standart yeni nesil sıralama yordamlarını izleyerek birikmeye (eşitlikçi tutarlar) ve sıraya konmaya hazırdır.