Este artículo describe un protocolo ChIP-Seq semiautomatizado y microescalado de regiones de ADN asociadas con una modificación específica de histonas (H3K27ac) utilizando una plataforma de manejo de líquidos ChIP, seguida de la preparación de la biblioteca mediante tagmentación. El procedimiento incluye la evaluación de control con fines de calidad y cantidad y puede adoptarse para otras modificaciones de histonas o factores de transcripción.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-Seq) es un enfoque poderoso y ampliamente utilizado para perfilar el ADN de cromatina asociado con modificaciones específicas de histonas, como H3K27ac, para ayudar a identificar elementos de ADN cis-reguladores. El proceso manual para completar un ChIP-Seq requiere mucha mano de obra, es técnicamente desafiante y, a menudo, requiere números de células grandes (>100,000 células). El método descrito aquí ayuda a superar esos desafíos. Se describe en detalle un procedimiento completo semiautomatizado y microescalado H3K27ac ChIP-Seq que incluye fijación celular, cizallamiento de cromatina, inmunoprecipitación y preparación de la biblioteca de secuenciación, para lotes de 48 muestras para entradas de número celular inferiores a 100,000 células. La plataforma semiautónoma reduce la variabilidad técnica, mejora las relaciones señal-ruido y reduce drásticamente la mano de obra. De este modo, el sistema puede reducir los costos al permitir volúmenes de reacción reducidos, limitando el número de reactivos costosos como enzimas, perlas magnéticas, anticuerpos y tiempo práctico requerido. Estas mejoras en el método ChIP-Seq se adaptan perfectamente a los estudios epigenéticos a gran escala de muestras clínicas con un número limitado de células de una manera altamente reproducible.
El amplio uso de ensayos ChIP-Seq para determinar fragmentos de ADN asociados con modificaciones específicas de histonas se debe en parte a su capacidad para identificar elementos de ADN cis-reguladores, incluidos potenciadores activos, promotores, silenciadores, heterocromatina y otros1,2,3,4. La identificación de regiones reguladoras no codificantes en todo el genoma ha demostrado una valiosa información para comprender mejor la regulación génica en la salud y las enfermedades4. Trabajos previos del laboratorio han utilizado ChIP-Seq para demostrar que los elementos cis–reguladores pueden desempeñar un papel importante en diferentes tipos de células5. Los ensayos chIP del factor de transcripción (TF) se han utilizado para mostrar polimorfismos de un solo nucleótido de riesgo asociado a la enfermedad6.
El uso de ChIP-Seq con muestras clínicas humanas es un desafío, principalmente debido a la limitación del número de células o la muestra de tejido deseada. Como resultado, ha habido un esfuerzo concertado en el campo para mejorar y microescalar estas técnicas y, como resultado, han surgido varios ensayos, como CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Este ensayo utiliza una transposasa para etiquetar y aislar regiones genómicas unidas por un anticuerpo específico9. Esta técnica ha sido capaz de reducir el número de células a 1.000s y en algunos casos a una sola célula, sin embargo, el uso de esta técnica en la investigación traslacional y la configuración clínica ha mostrado limitaciones debido a los requisitos de uso de células vivas para este método9,12. El requisito de células vivas hace que las muestras clínicas sean logísticamente difíciles de manejar y puede introducir efectos de lote si las muestras no se procesan al mismo tiempo. Otros han optimizado las técnicas a microescala para células fijas de formaldehído, incluido el desarrollo de ChIPmentation11,que se adapta aquí de una manera de alto rendimiento. El uso de celdas fijas permite almacenar muestras hasta la recolección y el posterior procesamiento de todas las muestras juntas para minimizar los efectos por lotes.
Aquí, se describe un ensayo ChIP-Seq microescalado semiautomatizado que reduce el tiempo práctico experimental para perfilar las modificaciones de histonas10. El método semiautomatizado permite ensayos ChIP-Seq de alto rendimiento, lo que permite que hasta 48 muestras se procesen completamente y estén listas para su secuenciación en tan solo 5 días, para tan solo 10,000 células por muestra utilizando un manipulador de líquidos ChIP. El manipulador completa la inmunoprecipitación (IP) y los lavados posteriores de forma autónoma, lo que ayuda a reducir la variabilidad entre muestras. El método semiautomatizado reduce tanto el tiempo práctico en más de 15 h para 48 muestras como la variabilidad técnica, lo que permite realizar estudios epigenéticos a gran escala de manera reproducible y rápida para células primarias o cultivadas. El protocolo explica el proceso de principio a fin para ChIP-Seq de alta calidad. Si las máquinas específicas no están disponibles, el protocolo seguirá siendo un recurso útil para configurar y solucionar problemas de los experimentos ChIP-Seq manualmente.
El ensayo se realizó con tres tipos diferentes de células inmunes humanas primarias y una línea celular cultivada (HUT78 – ATCC: TIB-161). Para mayor claridad, el protocolo se ha dividido en siete secciones: fijación celular, cizallamiento de cromatina a través de sonicación, inmunoprecipitación automatizada de cromatina, preparación de bibliotecas por tagmentación de fragmentos de ADN, amplificación de bibliotecas, purificación de bibliotecas, seguida de cuantificación de ADN. Para obtener recetas de tampón, consulte la Tabla suplementaria 1.
El método descrito aquí amplía el procedimiento de ChIPmentation11, que implementa un protocolo de preparación de la biblioteca de tagmentación antes de la purificación del ADN, mediante la automatización y microescala del protocolo. Desde el inicio de ChIP-Seq, el número de células requeridas se ha reducido drásticamente, de aproximadamente 20 millones de células para histonas a cientos e incluso células individuales1,7,10,12,18,19,20,21. Estos métodos recientemente desarrollados han permitido una comprensión más profunda de cómo los mecanismos cis-reguladores están funcionando en las células al aumentar la sensibilidad y permitir que se prueben poblaciones de células clínicas raras5,6,12,17. Por ejemplo, uno de los procedimientos más recientes y populares, llamado CUT&TAG, como alternativa ChIP-Seq robusta y sensible9. Produce una excelente relación señal-ruido ya que la enzima Tn5 se une covalentemente a la proteína A y reconoce la cadena Fc del anticuerpo ChIP con alta especificidad9. La actividad de fondo de la enzima Tn5 se reduce ya que la enzima no es funcional antes de unirse al anticuerpo objetivo9. Sin embargo, la implementación de este método en un contexto clínico es limitada, ya que requiere células vivas no fijas. Además, la eliminación de fragmentos de ADN del núcleo hipotónico podría tener efectos negativos en la cromatina a medida que se elimina durante el ensayo. El requisito necesario para trabajar con células frescas y vivas es una fuente de problemas para muestras clínicas raras y para grandes cohortes de muestras, ya que las cohortes grandes pueden tardar numerosos años en recolectar5. Otro tipo de método, drop-ChIP, utiliza elegantemente un dispositivo de microfluídica para generar etiquetas basadas en gotas antes de procesar el ChIP19. Sin embargo, utiliza un dispositivo microfluídico altamente especializado y, si bien es posible completar ChIP-Seq de una sola célula, también se limita al uso de células vivas7,8,9,18,19. Los métodos más nuevos que se basan en ChIP-Seq, como PLAC-Seq o HiChIP, intentan comprender las interacciones de 3 dimensiones (3D) entre los picos ChIP-Seq22,23. Estos métodos 3D son emocionantes, ya que están identificando interacciones cis-reguladoras o mediadas por TF en todo el genoma y una mejor comprensión de la regulación de la expresión génica en tipos celulares de interés, en tejidos sanos y en el contexto de la enfermedad.
Hay algunos pasos críticos a considerar para que el protocolo tenga éxito, como la calidad de la cromatina sonicada y la calidad del anticuerpo. La eficiencia de cizallamiento es crítica, si la cromatina no se sonica bien, la eficiencia del ensayo disminuye drásticamente24. La sonicación es un aspecto desafiante de ChIP-Seq debido a los números de celda requeridos. En el sonicador utilizado en el protocolo, la eficiencia se redujo drásticamente en menos de 300.000 células. Este es un aspecto desafiante en ChIP-Seq, ya que sonicar por debajo de ese nivel a menudo requeriría fragmentación enzimática, que es menos imparcial. Como resultado, la sonicación es un factor limitado importante para el verdadero ChIP-Seq a microescala. Otras plataformas de sonicación y kits disponibles comercialmente se probaron para sonicar la cromatina, pero el sonicador utilizado aquí tuvo los resultados más robustos y reproducibles. Otra ventaja del sonicador es no tener que comprar tubos especializados para ejecutar la sonicación, lo que reduce los costos cuando se trata de una gran cantidad de muestras. Para una sonicación óptima, en primer lugar, es importante precalentar el sonicador como se describió anteriormente. En segundo lugar, para lisar el pellet, se recomienda que la punta de la pipeta toque la parte inferior del tubo mientras se lisa para romper las células con más restricciones físicas. En tercer lugar, cualquier formación de burbujas antes de la sonicación dificulta la capacidad de la muestra para ser sonicada de manera uniforme. Si hay burbujas formadas durante la lisis, es importante eliminarlas con una pipeta. Esto puede ser un desafío sin eliminar una gran cantidad de muestra, pero si la punta se presiona ligeramente contra la burbuja, se puede extraer lentamente sin pérdida de mucha muestra. Por último, al determinar el número de ciclos, complete un curso de tiempo donde cada tres ciclos, la muestra se elimina, se purifica y se ejecuta en un gel de agarosa. Evite la sonicación excesiva / insuficiente de las muestras, ya que esto disminuye la eficiencia de ChIP. Si la muestra está subsónica, los fragmentos grandes pueden tener un efecto negativo en la calidad ChIP-Seq24. Por otro lado, si la muestra está sobresonada, existe el riesgo de que el epítopo objetivo se pierda en el proceso.
Otra parte esencial de ChIP-Seq es la calidad del anticuerpo. Antes de realizar cualquier estudio a gran escala, es necesario optimizar el anticuerpo que se utilizará. El objetivo es obtener una relación señal/ruido significativamente alta de las regiones conocidas del genoma y otra es la reproducibilidad. Si el anticuerpo está tirando de una gran cantidad de señal de fondo, se puede recomendar usar una entrada más grande o probar un lote / proveedor diferente. Esto agregará tiempo antes de comenzar un experimento a gran escala, pero es un paso esencial. Para detectar la señal a ruido, se recomienda usar qPCR con regiones que se sabe que son un objetivo de su anticuerpo y otra región que se sabe que está ausente. Se ha notado que las modificaciones de histonas son más robustas y fáciles de optimizar que las TF.
El protocolo descrito anteriormente proporciona un método robusto para la modificación de histonas de alto rendimiento ChIP-Seq de una manera semiautónoma y microescalada. El método limita la cantidad de tiempo práctico y aumenta la reproducibilidad sobre chIP-Seq manual. Estudios previos realizados en el laboratorio utilizaron ChIP manual sobre réplicas técnicas y obtuvieron una correlación de Spearman promedio de 0,505,sin embargo, con el sistema semiautomatizado, la correlación de Spearman entre diferentes donantes con un promedio de células NK de 0,66(Tabla suplementaria 2). Esto también se completó con aproximadamente un 40% menos de tiempo práctico. El método descrito aquí ha sido optimizado para modificaciones de histonas (H3K27ac se muestra aquí, pero el protocolo no debería necesitar ninguna modificación para otros) y solo requeriría modificaciones menores para ser implementado para TF ChIP-Seq. A pesar de la calidad del anticuerpo, la principal modificación sería para el tiempo de sonicación y potencialmente los buffers utilizados durante la IP. Por lo general, para los ensayos de TF ChIP, el método puede funcionar mejor con fragmentos ligeramente más largos de cromatina (con un rango de alrededor de 350-800 pb) ya que los complejos TF: DNA probablemente sean menos capaces de mantenerse a través de una sonicación rigurosa6. Es posible que los búferes también deban cambiar a una mezcla personalizada u otros kits disponibles en la industria, ya que los TF pueden comportarse de manera diferente a las modificaciones de histonas.
Aunque el manipulador de líquidos ChIP automatizado se probó para tan solo 10,000 células, hubo una disminución notable en la reproducibilidad a concentraciones más bajas de cromatina. Debido a esto, el protocolo no se recomendó a menos de 10,000 células, siendo 100,000 células las condiciones óptimas. El protocolo también se completó utilizando búferes ChIP de la industria, lo que fue un gasto adicional pero proporcionó datos de mayor calidad. El protocolo podría modificarse con respecto a las condiciones de sonicación (siempre que la cromatina cortada se mantenga dentro del mismo rango), los tampones podrían personalizarse para la inmunoprecipitación (IP; se puede requerir optimización) o no se puede usar el manipulador de líquidos ChIP. Una limitación del protocolo es el uso del manipulador de líquidos ChIP, que puede ser una inversión costosa y solo puede ejecutar 16 muestras a la vez. El manipulador de líquidos ChIP se limita a reacciones a pequeña escala y no se recomienda un número de células superior a un millón. Sin embargo, el protocolo podría completarse sin él, completando los pasos de IP y lavado manualmente. Si la IP y los lavados se completaron a mano, el tiempo para completar el ensayo aumentará y la reproducibilidad puede disminuir, pero esta guía seguirá siendo útil para ejecutar un experimento ChIP-Seq de alta calidad. Cabe destacar que otros manipuladores de líquidos podrían adaptarse para ejecutar reacciones ChIP semiautomatizadas.
En resumen, los principales beneficios de este sistema es la naturaleza de alto rendimiento, ya que los pasos de IP y lavado se completan de forma autónoma. Como tal, se pueden completar rondas secuenciales de experimentos ChIP, lo que permite que hasta 48 muestras se procesen completamente y estén listas para la secuenciación en 5 días, con un tiempo práctico limitado en comparación con los experimentos manuales ChIP-Seq. Otro beneficio es el aumento de la reproducibilidad ya que ChIP-Seq puede ser difícil de obtener resultados altamente reproducibles. Otros métodos requieren células vivas, sistemas complejos de microcantilización o que el trabajo se complete a mano. Este sistema tendrá que ser optimizado para muestras de baja entrada (<10.000 células), permitiendo en última instancia reacciones ChIP de una sola célula. El sistema también es capaz de ser adaptado para los nuevos métodos ChIP, como PLAC-Seq y HiChIP22,23.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Vijayanand por la ayuda técnica y las discusiones constructivas y al Dr. Sharron Squazzo y al Sr. Geoffrey Berguet de Diagenode por la asistencia técnica con el sonicador y la máquina y los protocolos de manejo de líquidos ChIP. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) y S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips | Diagenode | C30020002 | Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip |
AMPure XP for PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | SPRI beads |
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-060-C | 0.65 mL low binding tube |
Bioruptor Pico Sonicator | Diagenode | B01060010 | Sonicator used in the lab but others can be used |
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) | Zymo Research | D5205 | DNA clean-up kit |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | ThermoFisher | 10001D | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | ThermoFisher | AM9260G | |
EGTA pH 8.0 | Millipore Sigma | E3889-25G | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000667 | |
Formaldehyde solution | Millipore Sigma | 252549-1L | |
Glycine | Millipore Sigma | 50046-250G | |
H3K27ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410196 | |
HEPES (1 M) pH 7.5 | ThermoFisher | 15630080 | |
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes | Illumina | 20027213 | |
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit | Illumina | 20034197 | |
IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 | PCR mix |
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact | Diagenode | C30020003 | |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher | R0971 | |
N,N-Dimethylformamide | Millipore Sigma | D4551-250ML | CAUTION – low flash point |
NaCl (5 M), RNase-free | ThermoFisher | AM9760G | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | |
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps | USA Scientific | 1402-4700 | 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip |
Proteinase Inhibitor Cocktail | Millipore Sigma | P8340 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
PureLink RNase A (20 mg/mL) | ThermoFisher | 12091021 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher | P7581 | Used in the flourescence quantification |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4485699 | qPCR |
ROX Reference Dye | ThermoFisher | 12223012 | |
Sodium butyrate | Millipore Sigma | 303410-100G | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher | S11494 | nucleic acid dye |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X concentrate in DMSO | ThermoFisher | S7563 | |
TE Buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
Tips (bulk) | Diagenode | C30040020 | Tips for the IP Star |
True MicroChIP Kit | Diagenode | C01010130 | Contains all the buffers for the IP; ChIP kit |
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 |