Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

De Institutional Review Board (IRB) van het La Jolla Institute for Allergy and Immunology (LJI; IRB protocol nr. SGE-121-0714) keurde de studie goed. Gezonde vrijwilligers werden gerekruteerd en verstrekten leukaferesemonsters na schriftelijke geïnformeerde toestemming. 1. Celfixatie Breng de celsuspensieconcentratie op 1 tot 2 x10 6 cellen / ml met volledig celkweekmedium in een buis van 15 ml (<10 ml suspensie) of 50 ml buis (10-30 ml cellen). Als <1 x 106 cellen, gebruik dan 0,5 ml van het medium in een buis van 1,5 ml. Draai de celsuspensie voorzichtig, voeg 10x celfixatiebuffer druppelsgewijs toe (1:10; vol:vol) en draai met een lage snelheid gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Stop de reactie door voorzichtig te vortexen en voeg 2,5 M glycine toe in de verhouding 1:20 (vol:vol). Keer de buizen een paar keer om en incubeer minstens 5 minuten op ijs. Voer de resterende stappen uit bij 4 °C of op ijs. Draai de buisjes gedurende 5 minuten bij 4 °C op 800 x g en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet voorzichtig met 5 ml ijskoude 1x PBS en incubeer gedurende 2 minuten op ijs. Herhaal 1,4 en 1,5 met 1 ml ijskoude 1x PBS en breng het monster over naar een voorgekoelde buis van 1,5 ml (gelabeld voor langdurige opslag). Indien van toepassing wordt de bereiding van aliquots aanbevolen. Draai de buisjes op 1.200 x g bij 4 °C en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Vries de pellet in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C.LET OP: Neem de juiste bescherming bij het hanteren van vloeibare stikstof. 2. Chromatine scheren OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor het chromatine afschuiven van pellets met 0,3 tot 3 x 106 cellen in 0,65 ml laagbindende buizen. Verwijder de monsterbuis met bevroren celkorrels vanaf -80 °C en bewaar op droogijs om ontdooien van de pellet te voorkomen voordat de lysisbuffer wordt toegevoegd. Deze stap is van cruciaal belang. Voeg 70 μL verse, RT complete lysisbuffer toe aan de pellet en houd 1 minuut bij RT. Resuspend de pellet gedurende 1 minuut zonder dat er bubbels ingebracht worden en incubeer vervolgens de celsuspensie bij RT gedurende 1 minuut voordat u het monster op ijs legt. Breng de geresuspendeerde pellet over in een laagbindende buis van 0,65 ml en houd op ijs.OPMERKING: Om reproduceerbare ultrasoonapparaat te verkrijgen, verwarmt u de sonicator vooraf door deze gedurende 3-6 cycli met alleen lege buizen te laten draaien voordat de monsters worden gesoniseerd. Plaats de monsters in de buishouder van de sonicator en vul eventuele openingen op met balansbuizen gevuld met 70 μL water. Laat de monsters ongeveer 1 minuut in het waterbad liggen voordat u met de ultrasoonapparaat begint. Voer ultrasoonapparaat uit voor x-cycli (afhankelijk van het celtype) met 16 s AAN / 32 s UIT per cyclus.OPMERKING: Deze stap vereist validatie-experimenten om het optimale aantal cycli te bepalen voor efficiënte ultrasoonapparaat. Verwijder na elke 3 cycli de monsters uit de sonicator, draai voorzichtig en puls de buizen voordat u ze terug in de houder plaatst. Zorg ervoor dat er geen kleine druppeltjes aan de buitenkant van de buis zitten, want dat kan bubbelvorming veroorzaken. Na het voltooien van de benodigde cycli, spin monsters met >14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde, laagbindende laagbindende buis van 0,65 ml en blijf op ijs. Decrosslink een fractie van de gesonificeerde monsters om te controleren op de ultrasoonapparaatefficiëntie. Breng 1-7 μL van het supernatant (overeenkomend met ongeveer 250 ng geschoren chromatine) over naar een PCR-buis van 0,2 ml en maak het volume tot 10 μL met kortdurende lysisbuffer bij RT. Voeg 1 μL RNase A toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C bij 800 tpm en voeg vervolgens 1 μL proteïnase K toe. Incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C met schudden bij 1.000 tpm. Verwijder 2 μL van het gedecrosslinkte monster voor DNA-kwantificering met behulp van fluorescerende kwantificeringstest10 (een spectrofotometer wordt niet aanbevolen omdat zeep en afgebroken eiwit vertekening in de resultaten kunnen veroorzaken). Voer het resterende monster uit op een 1,2% agarosegel gedurende 1 uur bij 70 V. Kleur met nucleïnezuurkleurstof (1:20.000) en lees de gel af met een UV-transilluminator. Bereid chromatinevoorraad aliquots voor opslag (verdun het monster tot 25 ng/μL in 20 μL met volledige lysisbuffer). Bewaar alle afgeknipte chromatine bij -80 °C. 3. Geautomatiseerde ChIP-Seq voor histonmodificatie OPMERKING: Dit protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd op een ChIP-vloeistofhandler. Hoewel het systeem aangepaste buffers kan gebruiken, worden alle buffers geleverd met de ChIP-kit. De ChIP-strips met 8 buizen die in deze sectie worden gebruikt, zijn specifiek voor de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine. Breng 16 aliquots met 500 ng geschoren chromatine over in 20 μL van -80 °C en leg ze op ijs om het chromatine langzaam te ontdooien. Eenmaal volledig ontdooid, vortex kort en pulse-spin. Bereiding van chromatine Pipetteer 100 μL tC1 buffer aangevuld met 1x proteaseremmer en 20 mM natriumbutyraat (complete tC1 buffer) in twee ChIP 8-buis strips. Breng 20 μL van elk chromatinemonster over in een geschikte buis van de ChIP 8-buisstrips met de 100 μL volledige tC1-buffer. Was de chromatinebuizen door 80 μL volledige tC1-buffer toe te voegen aan de chromatinebuizen en breng vervolgens terug in de juiste buis van de ChIP 8-buisstrips voor een eindvolume van 200 μL. Bereiding van het antilichaam Bereken het volume van het antilichaam zodanig dat 0,5 μg antilichaam zich in elke buis bevindt.Volume antilichaam = (aantal monsters x antilichaam per reactie) / antilichaamconcentratie Voeg de berekende hoeveelheid antilichaam toe aan 500 μL tBW1-buffer. Snel vortex en pulse-spin. Pipetteer 70 μL tBW1 in elk van de twee ChIP 8-buisstrips en voeg 30 μL van het antilichaam + tBW1 toe aan elk van de buizen. Dit brengt het totale volume in elk van de buizen op 100 μL. Bereiding van de magnetische kraal Vortex het eiwit A-kraaloplossing grondig. Pipetteer voor 0,5 μg antilichaam 5 μL kralen in een nieuwe set ChIP 8-buisstrips en pulsspin. Vul de laatste rij van de ChIP vloeistofbehandelingskast met gelabelde, lege ChIP 8-buis strips. Volg de ChIP-16-IPure-200D programmaspecificaties voor de plaatsing van alle strips in de ChIP vloeistofbehandelingsmachine. Voeg de buffers in de juiste positie toe, maar gebruik tW4 in plaats van tE1-buffer.OPMERKING: Organiseer de dag zodanig dat de ChIP-vloeistofhandler de ChIP ‘s nachts zal uitvoeren. Het programma loopt ongeveer 16 uur voor 16 monsters. Dit markeert het einde van dag 1. 4. Transposase integratie van bibliotheekadapters voor bibliotheekvoorbereiding Stel een thermomixer vooraf in op 37 °C en 500 tpm. Koel een magneet af voor 0,2 ml buisstrips op ijs. Bereid voor 16 monsters 440 μL tagmentatiebuffer op ijs. Pipetteer 53 μL in een enkele nieuwe 8-buiss strip en houd op ijs. Voeg in een nieuwe 0,2 ml 8-buisstrip 220 μL koude tC1-buffer toe en houd op ijs. De 8 stripbuizen kunnen dit volume vasthouden en toch worden afgedekt. Verwijder de stripbuis “IP-monsters” uit de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine (rij 12) en sluit de buizen af voordat de puls wordt gedraaid. Vang de kralen op met behulp van de magneet voor 8-buis strips gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant. Breng 25 μL van de tagmentatiebuffer over op de kralen met een meerkanaalskanaal, verwijder uit de magneet en meng voorzichtig totdat de kralen homogeen zijn (ongeveer 5 keer op en neer met de pipet ingesteld op 20 μL). Sluit de buizen af en plaats in de voorverwarmde thermomixer en incubeer gedurende 3 minuten. Het verhogen van de tijd zal de efficiëntie van de bibliotheekvoorbereiding verminderen. Breng de buizen over in een gekoeld metalen rek en voeg 100 μL gekoelde tC1-buffer toe aan elk monster. Stel een meerkanaalspipet in op 80 μL en meng het monster totdat de kralen homogeen zijn, waardoor de tagmentatiereactie wordt gestopt. Plaats de monsters terug in de ChIP-vloeistofbehandelingsmachine en ga verder met de wasprocedure Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Zorg ervoor dat het wassen twee keer wordt uitgevoerd met tC1-buffer en twee keer met tW4. De elutie moet worden voltooid zoals aangegeven door de lay-out van het programma, met buffer tE1. Decrosslinking van het DNA Verwijder de ChIP 8-buisstrips in de laatste rij van de ChIP-vloeistofbehandelingskast en voeg 2 μL RNase A toe aan elk monster. Dop de buizen, pulsspin, meng de kralen voorzichtig met een meerkanaalspipet tot het mengsel homogeen is en sluit de buizen opnieuw af. Incubeer de monsters in een thermomixer gedurende 30 minuten bij 37 °C en 900 tpm. Verwijder de monsters uit de thermomixer, voeg 2 μL Proteinase K toe. Volg na de toevoeging dezelfde procedure als 4.9.2. Incubeer de monsters in een thermomixer gedurende 4 uur bij 55 °C en 1.250 tpm, gevolgd door 65 °C bij 1.000 tpm gedurende de nacht.OPMERKING: Dit is het einde van dag 2. 5. Gelabelde DNA-fragmenten zuivering Label zestien buisjes van 1,5 ml met het juiste monsternummer en voeg 400 μL DNA-bindingsbuffer uit de DNA-opruimkit toe aan elk. Verwijder de strips met 8 buizen uit de thermomixer en draai de strips om ervoor te zorgen dat elk verdampt product behouden blijft. Plaats strips op een 8-strip magneet om de kralen op te vangen. Breng 100 μL gedecrosslinkt DNA over in elk van de 1,5 ml buisjes. Voeg 100 μL van de DNA-bindingsbuffer toe aan de strips met 8 buizen om de kralen te wassen en breng vervolgens over naar de juiste buis van 1,5 ml. Vortex voor ongeveer 10 s en pulse-spin de 1,5 ml buizen. Laad de kolommen met de 600 μL die de DNA-bindingsbuffer en het ChIP-monster bevat. Spin monsters gedurende 20 s bij 10.000 x g en laad de kolom opnieuw met de doorstroom. Draai opnieuw onder dezelfde omstandigheden en gooi de doorstroming weg. Was de kolommen tweemaal met een wasbuffer van 200 μL (dezelfde centrifugering als de vorige stap) en gooi de doorstroming weg. Droog de kolommen door 2 min te centrifugeren op 12.000 x g. Breng de kolom over naar een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml en voeg 9 μL warme TE Buffer (voorverwarmd tot 55 °C) rechtstreeks toe aan de kolommatrix. Laat de kolom 1 minuut incuberen voordat u 1 minuut centrifugeert bij 10.000 x g. Breng de 9 μL van de eluut over in een geschikte nieuwe set strips met 8 buizen. Vul de elutie opnieuw aan met 8 μL TE Buffer zoals voorheen. Breng het eluut over in de juiste stroken met 8 buizen (eindvolume 17 μL per monster) en bewaar het op ijs. 6. Versterking en grootteselectie van de gezuiverde monsters De volgende stappen gebruiken qPCR om het aantal cycli te bepalen dat nodig is voor optimale versterking (CtD – Ct-bepaling) Bereid de CtD-mix voor alle monsters door de inhoud van de CtD-mixbuffer te vermenigvuldigen met het aantal monsters. Doseer 3,6 μL CtD-mix in een qPCR-plaat en voeg 1,4 μL getagde DNA-monsters toe (~ 10% van het totale volume). Voer de volgende qPCR uit: 98 °C gedurende 3 minuten, 72 °C gedurende 5 minuten, 98 °C gedurende 30 s, 26 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 63 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s. Bereid de Amp Mix voor alle monsters door de inhoud van de AMP Mix Buffer te vermenigvuldigen met het aantal samples. Doseer 14 μL gelabeld DNA in afzonderlijke putjes van een PCR-plaat en voeg vervolgens 2,5 μL van twee sequencing indexprimers (25 μM) toe aan elk monster (het uiteindelijke reactievolume is 50 μL). Meng de monsters met een meerkanaalspipet en voer het versterkingsprogramma uit dat in de CtD wordt gebruikt met het juiste aantal cycli.OPMERKING: Dit is een goed stoppunt omdat de versterkte monsters een paar weken bij -20 °C kunnen worden bewaard. De zuivering kan echter op dezelfde dag worden voltooid. Voor 48 monsters werden de stappen 3 – 6.5 voltooid met twee andere afzonderlijke batches en vervolgens versterkt in één batch zoals hieronder beschreven. Voer post-amplificatie, grootteselectie en kwantificering van getagd DNA uit zoals hieronder beschreven. Dit kan meestal worden aangevuld met 48 monsters (kan naar wens met minder monsters worden aangevuld). Voeg 90 μL paramagnetische kralen (1:1,8 verhouding) toe aan elke put, meng en laat het 2 minuten incuberen bij RT. Vang de kralen op met een plaatmagneet en gooi het supernatant weg. Was de kralen 3 keer met 200 μL verse 80% ethanol zonder de kraalkorrel te verstoren. Verwijder overtollige ethanol met 20 μL tips na de laatste wasbeurt en laat de kralen 10 minuten drogen of totdat er scheuren in de kralenkorrels verschijnen. Terwijl de plaat nog op de magneet zit, voeg je 40 μL van het voorverwarmde water toe aan elke put. Sluit de plaat af, vortex grondig en puls de plaat kort. Vang de kralen op door de plaat terug op de magneet te plaatsen en breng de 40 μL eluut over naar een nieuwe “monster” plaat. De monsters worden nu gezuiverd en de volgende stappen verrijken fragmenten variërend van 200-1.000 bp. Optionele QC-stap: Verwijder 4 μL uit de monsters en breng over naar een QC-plaat. Voeg 4 μL water terug aan de monsters. Dit bepaalt het percentage grote fragmenten. Voeg 22 μL paramagnetische kralen (1:0,55 verhouding) toe aan de monsters, meng voorzichtig en incubeer bij RT gedurende 2 minuten. Plaats op de magneet om de kralen gedurende 5 minuten te vangen en breng de supernatanten over naar kolommen 7-12 van de “monster” -plaat. Verwijder de plaat van de magneet en voeg 30 μL kralen toe (eindverhouding van 1:1,3). Meng voorzichtig en laat het 2 minuten op RT zitten. Vang de kralen gedurende 5 minuten en gooi het supernatant dan weg. Was alle kralen 3 keer met 200 μL vers 80 % ethanol zoals eerder beschreven (stap 6.6.2 – 6.6.3). Zodra de pellets droog zijn, elueert u DNA met 8 μL voorverwarmde TE-buffer naar elke put, terwijl u nog steeds op de magneet zit. Verwijder de plaat van de magneet, sluit af en vortex grondig af. Laat de plaat 2 minuten incuberen bij RT, pulse-spin, en plaats de plaat gedurende 2 minuten terug op de magneet. Breng het supernatant over op een nieuwe plaat (plaat 2). Herhaal voor maximaal herstel de elutie met een extra 8 μL voorverwarmde TE-buffer. Plaats de monsters in de juiste putjes, zodat elk monster 16 μL eindbibliotheek heeft.OPMERKING: Aan het einde van deze stap moeten er twee platen zijn (één als er geen QC-plaat is voltooid). De QC-plaat heeft de vooraf geselecteerde fragmenten en de tweede plaat moet 48 putjes van de uiteindelijke bibliotheek hebben (16 μL totaal). 7. Kwantificeer de uiteindelijke bibliotheken en QC-monsters met behulp van een fluorescentietest Volledige DNA-kwantificering met behulp van een fluorescentiekwantificeringstest of een vergelijkbare methode. Als de QC-kwantificering is voltooid, bepaalt u het percentage van het verlies van de steekproef dat werd < 1.000 bp. Er zou niet meer dan ongeveer 20% verlies moeten zijn – als er meer was, zou er een probleem kunnen zijn met de toegepaste kraalverhoudingen. Bepaal de grootte van de fragmenten van elk monster, bij voorkeur met behulp van een capillaire elektroforesemachine. Om de molaire concentratie te berekenen, gebruikt u de volgende vergelijking: [Bibliotheekconcentratie (ng/μL) * 106]/[660 * Mediane fragmentgrootte (bp)]).OPMERKING: De bibliotheken zijn klaar om te worden samengevoegd (equimolaire hoeveelheden) en gesequenced volgens standaard sequencingprocedures van de volgende generatie.