大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

ラホヤアレルギー免疫研究所(LJI;)IRB プロトコルいいえ。SGE-121-0714)は、研究を承認しました。健康なボランティアが募集され、書面によるインフォームド・コンセントの後に白血病サンプルを提供しました。 1. 細胞固定 細胞懸濁液濃度を15mLチューブ(<10mLの懸濁液)または50mLチューブ(10〜30mLの細胞)に完全な細胞培養培地を用いて1〜2 x 106 細胞/mLに持ち込みます。<1 x 106 細胞の場合、1.5mLチューブ内の培地0.5mLを使用してください。 セルサスペンションを穏やかに渦巻き、10x細胞固定バッファーを滴下(1:10;vol:vol)に加え、室温(RT)で10分間低速で回転させます。 穏やかに渦巻きで反応を停止し、1:20(vol:vol)の比で2.5 Mグリシンを加えます。チューブを数回反転し、氷の上で少なくとも5分間インキュベートします。 残りのステップは4°Cまたは氷上で行います。4°Cで5分間800 x g でチューブを回転させ、上清を捨てます。 5 mLの氷冷1x PBSでペレットを緩やかに再懸濁し、氷の上で2分間インキュベートします。 1 mLの氷冷1x PBSで1.4と1.5を繰り返し、サンプルを予冷した1.5 mLチューブ(長期保存用にラベル付け)に移します。該当する場合は、アリコートの準備をお勧めします。 4°Cで1,200 x gでチューブを回転させ、細胞ペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を取り除きます。液体窒素中のペレットを凍結スナップします。-80°Cで保管してください。注意: 液体窒素を取り扱う際には適切な保護を行ってください。 2. クロマチンせん断 注:このプロトコルは0.65 mL低結合管の0.3から3 x 106 細胞のクロマチンの剪断のために最適化されています。 サンプルチューブを-80°Cから凍結した細胞ペレットで取り出し、乾燥した氷の上に保管して、リシスバッファーを追加する前にペレットの解凍を避けます。この手順は非常に重要です。 ペレットに新鮮なRT完全なリシスバッファーの70 μLを追加し、1分間RTで保ちます。 ペレットを気泡を導入せずに1分間再懸濁し、サンプルを氷の上に置く前にRTで1分間培養します。 再懸濁されたペレットを0.65 mLの低結合チューブに移し、氷の上に置いてください。注:再現性の超音波処理を得るために、サンプルを超音波処理する前に3〜6サイクルのブランクチューブだけでそれを実行することによって、ソシレータを事前に暖めます。 サンプルを超音波処理器のチューブホルダーに入れ、70 μL の水で満たされたバランスチューブで隙間を埋めます。超音波処理を開始する前に約1分間、水浴中にサンプルを残します。 xサイクル(セルタイプに応じて)の超音波処理を実行します(セルの種類に応じて)。注: このステップでは、効率的な超音波処理のためのサイクルの最適な数を決定する検証実験が必要になります。 3サイクルごとに、超音波処理器からサンプルを取り出し、穏やかに渦を取り出し、パルスはホルダーに戻す前にチューブを回転させます。気泡形成を引き起こす可能性があるので、チューブの外側に小さな液滴がないことを確認してください。 必要なサイクルを完了した後、4°Cで15分間>14,000 x gでサンプルを回転させます。 上清を新しい、事前に冷却された低結合の0.65 mL低結合の管に移し、氷の上に保つ。 超音波処理効率をチェックするために超音波処理されたサンプルの一部をリンク解除します。 上清の1~7μL(約250ngのシアドクロマチンに相当)を0.2 mLのPCRチューブに移し、RTで短期溶解バッファを使用して最大10μLの体積を作ります。 1 μL RNase Aを加え、800 rpmで37°Cで30分間インキュベートし、1 μLプロテイナーゼKを加えます。 55°Cで2時間インキュベートし、1,000rpmで振る。 蛍光定量アッセイ10 を用いたDNA定量用の非架化サンプル2μLを除去する(分光光度計は石鹸と分解タンパク質が結果に偏りを生じさせる可能性があるとして推奨されない)。 残りのサンプルを70 Vのステインで1.2%のアガロースゲルで1時間実行し、UVトランスイルミエーターを使用してゲルを読み取ります。 クロマチンストックアリコートを貯蔵用に準備します(完全な溶解バッファーで20 μLでサンプルを25 ng/μLに希釈します)。すべてのシアクロマチンを-80°Cで保管してください。 ヒストン修正のための自動化されたChIP-Seq 注: このプロトコルは、ChIP 液体ハンドラ上で動作するように設計されています。システムはカスタマイズされたバッファを使用できますが、すべてのバッファは ChIP キットに付属しています。このセクションで使用される8本の管が付いているChIPストリップはChIPの液体ハンドラに特有である。 -80°Cから20μLに500ngのシアドクロマチンを含む16サンプルのアリコートを移し、氷の上に置いてクロマチンをゆっくりと解凍します。一度完全に解凍し、渦を短時間とパルススピン。 クロマチンの調製 1xプロテアーゼ阻害剤と20 mMナトリウムブチレート(完全なtC1バッファー)を2つのChIP 8チューブストリップに補ったtC1バッファーのピペット100 μL。 完全なtC1バッファーの100 μLを含むChIP 8管ストリップの適切なチューブに、各クロマチンサンプルの20 μLを移します。クロマチンチューブに80 μL完全tC1バッファーを加えてクロマチンチューブを洗浄し、ChIP 8チューブストリップの適切なチューブに戻して200 μLの最終容積に戻します。 抗体の調製 各チューブに0.5μgの抗体が入っている様に、抗体の体積を計算します。抗体の容量 = (反応あたりのサンプル x 抗体数) / 抗体濃度 tBW1バッファーの500 μLに、算出された量の抗体を追加します。素早く渦とパルススピン。 tBW1のピペット70 μLを2つのChIP 8チューブストリップのそれぞれに加え、各チューブに30 μLの抗体+tBW1を加えます。これにより、各チューブの総容積は100 μLになります。 磁気ビーズの調製 タンパク質Aビーズ溶液を徹底的にボルテックスする。0.5 μgの抗体の場合、ピペット 5 μL のビーズを新しいセットの ChIP 8 チューブストリップとパルススピンに組み込みます。 ChIP 液体ハンドラの最後の行にラベル付きの空の ChIP 8 チューブ ストリップを記入します。 ChIP-16-IPure-200Dプログラム仕様に従って、ChIP 液体処理機内のすべてのストリップを配置します。バッファーを正しい位置に追加しますが、tE1 バッファーの代わりに tW4 を使用します。メモ: ChIP 液体ハンドラが ChIP を一晩実行する日を整理します。プログラムは16サンプルで約16時間実行されます。これは 1 日目の終わりを示します。 4. ライブラリの準備のためのライブラリアダプタのトランスポザーゼ統合 サーモミキサーを37°Cおよび500rpmに事前に設定します。氷の上に0.2 mLチューブストリップのための磁石を冷却します。 16個のサンプルの場合、440 μLのタグメントバッファーを氷上に用意します。ピペット53 μLを1つの新しい8チューブストリップに入れ、氷の上に保管します。 新しい0.2 mL 8チューブストリップに、220 μLのコールドtC1バッファを追加し、氷の上に置きます。8つのストリップ管はこの容積を保持し、それでも上限を設けることができる。 ChIP液体ハンドラマシン(行12)から「IPサンプル」ストリップチューブを取り外し、パルス回転前にチューブをキャップします。8管ストリップ用のマグネットを2分間使用してビーズを取り込み、上清を慎重に取り除きます。 タグメント化バッファーの 25 μL をマルチチャネルでビーズに移し、磁石から取り出し、ビーズが均質になるまで穏やかに混ぜます(ピペットを20 μLに設定して約5倍上下に)。 チューブをキャップし、予熱熱したサーモミキサーに入れ、3分間インキュベートします。時間を増やすと、ライブラリの準備の効率が低下します。 チューブを冷やした金属ラックに移し、各サンプルに100 μLのチルドtC1バッファを追加します。マルチチャンネルピペットを80μLにセットし、ビーズが均質になるまでサンプルを混ぜて、タグメント反応を止めます。 サンプルを ChIP 液体ハンドラに戻し、洗浄手順 Washing_for_IP-reacts_16_Ipureに進みます。洗浄はtC1バッファで2回、tW4で2回行われます。溶出は、バッファ tE1 で、プログラムレイアウトによってマークされるように完了する必要があります。 DNAの逆リンク ChIP液体処理器の最後の行のChIP 8管ストリップを取り外し、各サンプルに2μL RNase Aを加えます。 チューブをキャップし、パルススピンし、混合物が均質になるまでマルチチャネルピペットでビーズを穏やかに混ぜ、チューブを再キャップします。 37°Cおよび900 rpmで30分間、サーモミキサーでサンプルをインキュベートします。 サーモミキサーからサンプルを取り出し、2 μLのプロテインナーゼKを加え、添加後の4.9.2と同じ手順に従います。 サンプルを55°Cおよび1,250 rpmで4時間熱ミキサーにインキュベートし、続いて1,000rpmで65°Cを一晩でインキュベートします。注:これは2日目の終わりです。 5. タグ付きDNA断片精製 適切なサンプル数で16個の1.5mLチューブにラベルを付け、DNAクリーンアップキットから400 μLのDNA結合バッファーをそれぞれに追加します。 サーモミキサーから8チューブストリップを取り外し、ストリップをパルス回転させて、蒸発した製品が保持されていることを確認します。8ストリップ磁石にストリップを置き、ビーズを取り込みます。 1.5 mLチューブのそれぞれに、100 μLの架橋解除DNAを移します。8チューブストリップに100μLのDNA結合バッファーを加え、ビーズを洗浄し、適切な1.5mLチューブに移します。 約10 sの渦とパルススピン1.5 mLチューブ。 DNA結合バッファーと ChIP サンプルを含む 600 μL でカラムをロードします。 10,000 x gで 20 s のスピン サンプルを実行し、フロースルーで列をリロードします。同じ条件で再びスピンし、フロースルーを破棄します。 200 μLの洗浄バッファーで2回洗浄し(前のステップと同じ遠心分離)、フロースルーを廃棄します。 12,000 x g で 2 分間遠心分離して柱 を乾燥 させます。 カラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに移し、9 μLのウォームTEバッファ(55°Cに予熱)をカラムマトリックスに直接追加します。10,000 x gで 1 分間遠心分離する前に 1 分間インキュベートするカラムを許可します。 9 μLのエルテを8チューブストリップの適切な新しいセットに移します。 8 μL TE バッファを使用して溶出を再度完了します。エルチを適切な8チューブストリップ(最終体積17μL/サンプル)に移し、氷の上に置きます。 精製サンプルの増幅とサイズ選択 次の手順では、qPCR を使用して、最適な増幅に必要なサイクル数を決定します (CtD – Ct の決定) CtD ミックス バッファの内容にサンプル数を掛けて、すべてのサンプルに対して CtD ミックスを準備します。 3.6 μLのCtDをqPCRプレートに混ぜて、タグ付きDNAサンプルを1.4 μL加えます(総体積の10%)。qPCR は、3 分間 98 °C、5 分間 72 °C、30 s の場合は 98 °C、10 s の 98 °C の 26 サイクル、30 s の場合は 63 °C、30 s の場合は 72 °C です。 AMP ミックス バッファの内容にサンプル数を掛けて、すべてのサンプルに対してアンプ ミックスを準備します。タグ付けされたDNAの14 μLをPCRプレートの別々のウェルに分配し、各サンプルに2.5 μLの2つのシーケンシングインデックスプライマー(25 μM)を加えます(最終反応容積は50μL)。 マルチチャンネルピペットでサンプルを混合し、適切なサイクル数でCtDで使用される増幅プログラムを実行します。注: 増幅されたサンプルは-20 °Cで数週間保存できるため、これは良い停止点です。しかし、精製は同じ日に完了することができます。48個のサンプルの場合、ステップ3~6.5は、他の2つの別々のバッチで完了し、次に、以下に説明する1つのバッチで増幅した。 後述の方法で、後の増幅、サイズ選択、およびタグ付けされたDNAの定量化を行います。これは通常、48個のサンプルで完了できます(必要に応じて少ないサンプルで完了できます)。 各ウェルに90 μL (1:1.8比) を加えて混合し、RTで2分間インキュベートします。 プレート磁石を使用してビーズを取り込み、上清を捨てます。ビーズペレットを破壊することなく、新鮮な80%エタノールを200 μLで3回洗浄します。 最終洗浄後に20μLチップを含む余分なエタノールを取り除き、ビーズを10分間乾燥させるか、ビーズペレットに亀裂が入るまで乾燥させます。 プレートを磁石の上に置いたまま、各ウェルに40μLの事前温水を加えます。プレートを密封し、渦を徹底的に密封し、プレートを短時間パルス回転させます。 プレートを磁石に戻してビーズを取り込み、40 μLのエルテを新しい「サンプル」プレートに移します。サンプルは精製され、次のステップは200〜1,000 bpの範囲の断片を濃縮する。 オプションのQCステップ:サンプルから4μLを取り出し、QCプレートに移します。サンプルに4μLの水を加えます。これは、大きなフラグメントの割合を決定します。 22 μL の常磁性ビーズ(1:0.55比)をサンプルに加え、慎重に混合し、RT で 2 分間インキュベートします。 磁石の上に置き、ビーズを5分間捕獲し、上澄み物を「サンプル」プレートの7〜12列に移します。磁石からプレートを取り出し、ビーズを30 μL(最終比1:1.3)を加えます。慎重に混ぜて、RTに2分間座るようにします。 5分間ビーズを取り込み、上清を捨てます。 前述のように、200 μLの新鮮な80%エタノールで3回すべてのビーズを洗浄します(ステップ6.6.2 – 6.6.3)。 ペレットが乾燥したら、8 μL の事前温め TE バッファーを持つ DNA を各ウェルに溶出し、磁石の上に置きます。 マグネット、シール、渦からプレートを徹底的に取り外します。プレートをRTで2分間インキュベートし、パルススピンし、プレートを磁石に戻して2分間置きます。上清を新しいプレート(プレート2)に移します。 最大の回復のために、予め温めたTEバッファの余分な8 μLの溶出を繰り返します。各サンプルが最終ライブラリの16 μLを持つような適切なウェルにサンプルを入れます。注: このステップの最後には、2 つのプレートが存在する必要があります(QC プレートが完成していない場合は 1 つ)。QCプレートには事前サイズ選択の断片があり、2番目のプレートには48個の最終ライブラリ(合計16 μL)のウェルが必要です。 7. 蛍光アッセイを用いて最終ライブラリとQCサンプルを定量化する 蛍光定量アッセイまたは同様の方法を用いた完全なDNA定量。 QC 定量が完了した場合、1,000 bp <されたサンプルの損失の割合を決定します。約 20% 以下の損失があるはずです – それ以上の場合は、適用されたビーズの比率に問題がある可能性があります。 各試料の断片の大きさを決定し、好ましくは毛細管電気泳動機を用いる。モル濃度を計算するには、[ライブラリ濃度(ng/μL)* 10 6]/[660* 中央値フラグメントサイズ(bp)]の式を使用します。注: ライブラリは、プール可能で (等量) し、標準の次世代シーケンス手順に従って順序付けされます。