مورين استئصال الجروح التئام نموذج وتحليل الجروح الفسطولوجي
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية توليد الجروح الثنائية ذات السماكة الكاملة في الفئران وكيفية مراقبة الجروح وحصدها وإعدادها لتحليلها. يتضمن وصفاً متعمقاً لكيفية استخدام أقسام النسيج التسلسلية لتحديد عيوب المورفوميات وتحديدها بدقة والكشف عنها.
Abstract
وقد استخدم نموذج الجرح استئصال المورين على نطاق واسع لدراسة كل من المراحل المتداخلة بالتتابع من التئام الجروح: التهاب, انتشار وإعادة عرض. يتلقّى مورين جروح هدّم جيّدا نوعيّة جيّدا ويمكن التعرف على سرير جرح على أيّ هذا مراحل مختلفة من ال يشفي عملية يكون قابل للقياس. داخل الحقل، من الشائع استخدام “وسط” محدد بشكل تعسفي للجرح لإجراء تحليلات النسيج. ومع ذلك، فإن الجروح هي كيان ثلاثي الأبعاد وغالباً ما لا تكون متماثلة من الناحية النسيجية، مما يدعم الحاجة إلى طريقة واضحة المعالم وقوية للقياس الكمي للكشف عن عيوب المورفوميتري ذات الحجم الصغير للتأثير. في هذا البروتوكول، نحن وصف الإجراء لإنشاء الثنائية، كامل سمك الجروح الختان في الفئران، فضلا عن تعليمات مفصلة حول كيفية قياس معلمات morphometric باستخدام برنامج معالجة الصور على أقسام تسلسلية مختارة. وتستخدم قياسات البعدين لطول الجرح، وطول البشرة، ومنطقة البشرة، ومنطقة الجرح بالاقتران مع المسافة المعروفة بين الأقسام لاستقراء منطقة البشرة ذات الأبعاد الثلاثة التي تغطي الجرح، ومنطقة الجرح العام، وحجم البشرة وحجم الجرح. على الرغم من أن هذا التحليل النسيجي التفصيلي يستهلك الوقت والموارد أكثر من التحليلات التقليدية ، فإن دقته تزيد من احتمال اكتشاف الأنماط الظاهرية الجديدة في عملية شفاء الجروح المعقدة بطبيعتها.
Introduction
التئام الجروح الجلدية هو عملية بيولوجية معقدة مع مراحل متداخلة بالتتابع. وهو يتطلب تنسيق العمليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيمها زمانيا ومكانيا من أجل استعادة وظيفة الحاجز للظهارة التالفة. في المرحلة الأولى، الالتهاب، العدلات والظامة تهاجر إلى الجرح، وحشد الدفاعات المحلية والنظامية1. وبعد المرحلة التحريضية وتداخلها هي مرحلة الانتشار. تبدأ الخلايا الليفية في الانتشار بسرعة والهجرة إلى أنسجة التحبيب. Keratinocytes بعيدا عن الحافة الرائدة تتكاثر اتجاهها نحو الجرح كما keratinocytes متباينة في الحافة الرائدة تهاجر لإعادة الظهارة الجرح2. وأخيرا، تبدأ مرحلة إعادة عرض ونضج، خلالها الخلايا الليفية في الأنسجة الحبيبية بدء توليف وإيداع الكولاجين. إعادة عرض وتنظيم المصفوفة الجديدة يمكن أن تستمر حتى 1 سنة بعد الإصابة3. بسبب تعقيد الأحداث المتداخلة التي تنطوي على عبر الحديث بين أنواع الخلايا المتعددة، وعلى الرغم من سنوات من البحث، العديد من الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة التئام الجروح لا تزال غير مفهومة.
نموذج الفأر هو نموذج الثدييات السائدة للتحقيق في آليات التئام الجروح نظرا لسهولة استخدامها، وانخفاض التكلفة نسبيا و المنقلبية الوراثية1،4،5. على الرغم من أن أنواع مختلفة من الجروح قد وصفت في نموذج مورين, الأكثر شيوعا هو جرح ختان (إما لكمة ثنائية أو خزعة لكمة مباشرة), تليها نماذج الجرح شقي4. نموذج الجرح الختان له ميزة متميزة على نموذج شقي كما أنه يولد بطبيعته الأنسجة السيطرة التي لم تخضع لعملية الشفاء. يمكن معالجة نسيج الخزعة التي يتم استئصالها كجزء من البروتوكول الجراحي بنفس الطريقة التي تتم بها معالجة الأنسجة المجروحة واستخدامها لتحديد الظروف المثلية للمعيار المطلوب. قد تكون أنسجة التحكم المُخَلَّة مفيدة أيضًا إذا قيّم آثار المعالجة المسبقة للجلد أو تأكيد التغيير الجيني الناجح في وقت الإصابة4.
يمكن تقييم المعلمات الشفاء من خلال العديد من التقنيات المختلفة، بما في ذلك قياس الألواح أو علم الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن تقييم المقاييس فقط تقييم الخصائص المرئية للجرح ، وبسبب وجود الجرب ، في كثير من الأحيان لا يرتبط بقياسات الشفاء التي تصورها الأنسجة ، مما يجعل علم الأنسجة “المعيار الذهبي” للتحليل4. على الرغم من التحليل النسيجي كونه معيار الذهب، وغالبا ما يتم تنفيذها على مجموعة فرعية تعسفية من الجرح6،7. على سبيل المثال، قطع الجرح في “نصف” قبل تضمين وقسمة الجرح هو حاليا ممارسة شائعة للحد من الوقت والموارد التي تنفق على مواد القسم وتحليل البيانات. وقد تم تطوير طريقة تحليل morphometric الموصوفة في هذا البروتوكول لتشمل كامل أنسجة الجرح، لتعكس بدقة الخصائص المورفولوجية للجرح، وزيادة احتمال الكشف عن عيوب التئام الجروح ذات الحجم الصغير. في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل طريقة جراحية لتوليد الجرح مورين الأكثر شيوعا درس، والثنائية كامل سمك الجرح الختان، فضلا عن طريقة مفصلة وصارمة لتحليل النسيجية نادرا ما تستخدم في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الجرح الختان الثنائي هو إجراء قابل للتخصيص للغاية والذي يمكن استخدامه لدراسة العديد من الجوانب المختلفة لتضميد الجروح. قبل البدء في مشروع التئام الجروح، يجب على المحققين إجراء تحليل للطاقة لتحديد عدد الجروح اللازمة للكشف عن عيب في حجم تأثير معين. توجد تناقضات داخل الأدبيات حول ما إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لجميع أعضاء مختبر دونوالد الذين ساهموا في تحسين هذا البروتوكول على مر السنين، ولجينا شاتيمان التي جعلت إصرارها في تعزيز استخدام قسم المسلسل لتحليل الجروح من الممكن إنشائها. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد القومية للصحة/NIAMS إلى مارتين دونوالد (AR067739).
Materials
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
