Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

1. Выражение белка, очистка и измерение SEC-SAXS основаны на опубликованном протоколе13 Кратко следуйте протоколу сбора данных SEC-SAXS (Brennich et al.6). Equilibrate SEC-колонка с по крайней мере 2 объемами столбца SEC работает буфер (20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 100 мМ. NaCl). Подготовь 50 л образца экзо минус E9 на уровне 8’u201210 мг/мл с 20% мл избыток частичного dsDNA (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC и GGCTAAACCGCTGTTATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT). E9 exoминус связывается с KD 12 ± nM (см. Дополнительные данные). Ввись 50 МКЛ этой смеси на SEC-колонку (S200 Increase) в ряд с ячейкой потока для измерений SAXS на уровне 0,3 мл/мин. Соберите 1000 кадров на 1 с экспозицией каждый.ПРИМЕЧАНИЕ: На луче BioSAXS BM29, в Европейском синхротронном комплексе (ESRF) отдельные кадры обрабатываются автоматически и независимо в рамках EDNA14. После сбора данных откройте базу данных ISPyB20 и под вкладкой сбора данных нажмите кнопку Go, чтобы получить доступ к набору данных и результатам автоматического анализа21. Скачать данные. 2. Первичный анализ данных Откройте java-программу Рассеяние IV (см. Таблица материалов) и выполнить фоновое вычитание данных хроматографии исключения размера (SEC).Откройте вкладку SEC. Перетащите и уроните уменьшенныефайлы данных(.dat)в окно “Drop Data ниже”. Установите выходной каталог “Out Dir ::”, нажав на кнопку выходного Dir с синей маркировкой.ПРИМЕЧАНИЕ: Если ваши данные были собраны в nm-1, коробка преобразования должна быть проверена (внизу слева от панели) при падении файлов в окно или вкладку вычитания. Редактировать экспериментальные детали, использовать кнопку Редактировать детали и заполнить как можно больше полей, как это возможно, они включают разделы, на которых источник / луч был использован для сбора данных, параметры сбора и детали выборки. Они будут сохранены с помощью данных и позволят легче заполнить раздел “Параметры сбора данных” в будущих публикациях. Введите имя образца в Сохранить как поле. Нажмите на TRACE.ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет два эффекта. Во-первых, он создаст файл для данных. Это единый текстовый файл, который будет собирать все экспериментальные наблюдения из отдельных файлов .dat файлов. Кроме того, файл «.sec» содержит усредненный набор кадров, который является буферным фоном, все кадры, используемые в усреднении, а также вычитаемые буферные кадры по всему эксперименту SEC-SAXS. Во-вторых, создается сигнальный сюжет, который отображает число кадров по сравнению с соотношением Integral к фону. Это показывает выбранные кадры (серые), которые были усреднились для вычитания буфера. Точки для среднего буфера определяются из всего диапазона данных. Тем не менее, желательно вручную выбрать буферные рамки для усреднения, так как плохо определенный фон может произойти из-за плохо уравновешенных или грязных столбцов или капиллярногозагрязнения 22. Выберите буферные кадры вручную. Нажмите Clear Buffers затем переизбирайте буферную область с левым щелчком мыши, на кривой трассировки. В идеале это должна быть плоская область перед пустотой, объем колонны SEC составляет около 100 кадров. Нажмите SET BUFFER, а затем обновление, чтобы пересчитать файл. Определите область интересов (ROI). На сигнальный сюжет выберите область пика интереса, с левым щелчком мыши.drag.ПРИМЕЧАНИЕ: Это заполняет три участка в правой панели. Два верхних участка связаны с перекрестием, перемещаясь между ними, второй участок сигнала (вверху справа) показывает только выбранную рентабельность инвестиций, с интенсивностью каждого кадра синим цветом и соответствующей Rg каждого кадра красным цветом и соответствующей тепловой картой ниже, показывая остатки для каждого кадра, окрашенного в соответствии с анализом автоматической корреляции Дурбин-Уотсон. Регионы с высоким сходством окрашены в синий цвет (Дурбин-Уотсон, d No 2), в то время как непохожие кадры будут следовать темные синие до розовых и, наконец, красные в зависимости от тяжести непохожести (d’gt; 2). Нижний участок является вычитаемой кривой I по сравнению с q для центрального выбранного кадра (также обозначаемого вертикальной линией). Клавиши стрелки могут быть использованы для навигации по вычитаемые кадры. Сюжет I против q продемонстрирует качество вычитаемых кадров из эксперимента SEC. Выберите кадры для слияния. Нажмите на перекрестие в графике тепловой карты, чтобы выбрать подмножество кадров, которые будут использоваться для слияния. Перекрестие определит треугольную область преимущественно сияного, который падает на правую нижнюю сторону перекрестия. Используйте мыши щелчок, чтобы установить эти кадры, как выбрано и выделить кадры в соответствующей области сигнала участка выше. Эти кадры должны идеально выделить область со стабильной Rg.ПРИМЕЧАНИЕ: По мере необходимости, увеличить на тепловой карте с левым щелчком мыши перетащить и увеличить с левым щелчком салфетки вправо. При удовлетворении выбранными кадрами щелкните MERGE. Это объединит вычитаемые кадры и представит их во вкладке ANALYSIS. 3. Деконволюция данных Откройте программу деконволюции (например, BioXTAS Raw 2.0.0). В программе деконволюции загрузите набор данных под вкладкой Файлы в панели управления,используйте символ foldether, чтобы найти данные или скопировать и вставить местоположение в адресную панель.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что папка содержит только необработанные файлы .dat и не обработанные или средние файлы данных. Выделите все файлы .dat, нажмете кнопку Серии Сюжетов, сюжет интегрированной интенсивности по сравнению с номером кадра будет нарисован в «Сюжете серии». В панели управления выберите вкладку серии, а затем нажмите, чтобы выделить кривую. Откройте всплывающее окно LC Analysis с помощью кнопки в основании панели управления. Это окно дает доступ к нескольким вариантам, таким как выбор различных типов молекул (белка или РНК). Это также позволяет пользователю выбрать буферную область для участка. В первом случае нажмите Auto; это должно выбрать подходящий буферный регион.ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не удается, возможно, из-за нестабильной базовой линии, то “Добавить регион” для оптимизации буферной области. Это заполняет поле Буфера с меньшим ящиком, в котором можно вручную добавить номера кадров для использования для буфера. Кроме того, нажмите кнопку “Pick”, чтобы дать возможность выбора области на участке. Найдите область, слева нажмите один раз для начала позиции, переместить курсор в следующую позицию и слева нажмите еще раз. Возможно, необходимо добавить несколько буферных мест. Нажмите Набор буфера и кривые будут вычтены и Rg рассчитывается через пик SEC. Если появляется всплывающее окно, нажмите OK. Чтобы начать анализ эволюционирующим фактором (EFA), нажмите правой кнопкой мыши на выделенный файл в нижней части Панель управления а затем выберите Efa из меню.Проверьте, открывается всплывающее окно, которое показывает разложение одного значения (SVD) набора данных. В поле управления проверьте поле Use Frames так, чтобы вся область пика для деконволюта была покрыта участком интенсивности. Участок “Особые значения”, в правом верхнем варианте, показывает интенсивность особых значений (отдельных пиков/видов) выше базового уровня.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество точек, присутствующих выше базового уровня, представляет собой количество присутствующих видов рассеяния. С оговоркой, что это относительная величина особого значения плоской области / базовой линии, что вопросы. Чтобы проверить количество отдельных значений, используйте нижний участок AutoCorrelation. Это показывает правый и левый векторы корреляции. Нажмите далее.ПРИМЕЧАНИЕ: Они по существу представляют собой профили рассеяния или концентрации вектора в растворе. Где абсолютный размер представляет значение вектора. Значительный компонент будет иметь автокорреляцию вблизи 1 (правило отсечения большого пальца составляет 0,6-u20120.7). RAW услужливо вычисляет это и отображается в #Significant SVs, внизу слева, хотя вы можете изменить это в случае необходимости. При нескольких отдельных значениях (например, 4 евро) может потребоваться взглянуть только на 2 или 3 компонента, изменив диапазон используемых данных. Чем меньше количество компонентов, тем легче будет анализ EFA, но за счет использования меньше данных. В сложной ситуации, когда левые и правые сингулярное векторы, которые должны быть похожи, не совпадают, уменьшают значительное число SV и уменьшают количество кадров, используемых до тех пор, пока левые и правые сингулярное векторы не будут похожи. Убедитесь, что EFA рассчитывается путем генерации участков в направлениях вперед и назад для каждого вектора. Эти участки показывают, когда компоненты запускаются (форвардный участок) и выходят (назад) профиль решения для выбранных данных SEC-SAXS. RAW пытается определить эти диапазоны; изменить их, используя стрелки рядом с счетчиками, так что каждый круг находится в начале точки перегиба, поднимающейся от или падающей к исходной линии. Нажмите далее.ПРИМЕЧАНИЕ: Последний этап EFA превращает векторы SVD обратно в кривые рассеяния. Слева от окна в верхней части построены ранее определенные диапазоны. Эти диапазоны являются ограничениями для определения того, где повернуть сингулярные векторы обратно в кривые рассеяния. Правая панель показывает эти соответствующие профили кривой рассеяния, для каждого разделенного пика. Сюжет для концентрации каждого пика, который должен быть репрезентативным для профилей elution и сюжет для среднего ошибка взвешенных чи2. Участок чи2 измеряет набор данных деконволюции к исходному набору данных. В идеале, это будет плоским, однако шипы часто можно увидеть. Попробуйте уменьшить или устранить шипы, изменив элементы управлениядиапазоном компонентов, сначала определите, какой кадр соответствует шипу (от chi2 участок), а затем, в диапазоне управления, который компонент содержит этот кадр (это может быть больше, чем один), используя стрелки, двигаться вверх или вниз соответствующего диапазона.ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно дать ответ, увеличивая или уменьшая всплеск. Если рама шипа присутствовала в более чем одном компоненте, то может потребоваться небольшое время проб и ошибок между каждым компонентом. Когда минимальный чи2 был достигнут, выполнить проверку проверки, нажав назад, предыдущее окно, как представляется, позволяют проверить, если изменения, внесенные резко изменили исходные участки EFA. Если они по-прежнему выглядят действительными, нажмите Далее. Нажмите Сохранить данные EFA, чтобы сохранить участки, а затем нажмите Готово; закрыть окно EFA.ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая проверка заключается в том, чтобы нажать от чек-бокс рядом с каждым компонентом диапазона, в свою очередь. Они обеспечивают положительное ограничение концентрации для каждого компонента и выключение будет проверять, если они существенно влияют на набор данных. Если на участке концентрации изменений не наблюдается, то данные действительны. Вернувшись в окно RAW, нажмите на вкладку Профили в панели управления, чтобы просмотреть кривые и во вкладке Манипулирование панели управления,манипулировать кривыми дальше или сохранить кривые, как файлы No .dat, нажав правой кнопкой мыши на файл и выбрав сохранить выбранный файл (ы) из меню всплывающее. Сохраните файл. Используйте Scatter IV для дальнейшего анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация и инструкции по деконволюции и EFA BioXTAS RAW можно найти https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. Определить свойства SAXS ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, в Bioisis.net. Здесь мы показываем основной шаг за шагом подход, подчеркивая наиболее полезные кнопки в Scatter. Во вкладке Scatter ANALYSIS нажмите кнопку G для ручного инструмента анализа Guinier справа от каждого файла образца. Сюжет, который открывается, показывает, что в верхней коробке находитсяln’i (q) и q2 в верхней коробке и соответствующие остатки в нижней коробке. Добавить или удалить точки таким образом, что остатки не имеют “улыбка” или “хмуриться” функцию. Выбранные данные в подгонки Guinier не должны превышать максимальный лимит q x Rg 1.3. Нажмите кнопку Нормализованный Кратки; участок, который всплывает обеспечивает полуколиченую оценку структурного состояния макромолекулы, нормализуется для массы и концентрации.ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрестие обозначает точку Guinier-Kratky на (√3, 1.1)19. Компактный сферический белок покажет один пик с максимальным значением в точке Гинье-Кратки. Внутренне неупорядоченно или цилиндрический биополимер будет иметь максимум больше, чем перекрестие и не будет уменьшаться. Белок, который имел как сложенные домены, так и длинные удлиненные неструктурированные регионы, может представлять 2000-й максимум через перекрестие, но также покажет очевидную тенденцию к снижению на более высоком q x Rg. Нажмите на кнопку Vc (Volume-of-correlation), которая воспитывает два участка, общую рассеянную интенсивность и интегрированную область общей рассеянной интенсивности в качестве функции q. Участки используются в качестве быстрой ссылки для проверки качества кривой рассеяния.ПРИМЕЧАНИЕ: Общая рассеянная интенсивность чувствительна к I(0), и если это не было измерено правильно, то сюжет не будет показывать непрерывную линию. Интегрированный участок области, в идеале, должен показать сигмоидную линию с расширенным плато для каждой кривой SAXS. При несоответствии/вычитании буфера агрегация или интерчастицное вмешательство в выборку наблюдаются при более высоких значениях q-значений. Нажмите кнопку Гибкость, чтобы начать анализ гибкости. Это откроет окно с четырьмя панелями и ползунок в нижней части. Каждая открытая панель показывает участок, эксплуатируемый отношения между властью и законом, который существует между компактными и удлиненными/гибкимибиополимами 23. Для использования переместите ползунок в нижней части коробки справа налево с нажатием кнопки левой мыши. Продолжайте медленно двигаться влево, пока плато в одном из участков не будет достигнуто.ПРИМЕЧАНИЕ: Если плато видно на участке Пород-Дебье, то образец компактный по своей природе, который должен соответствовать одной вершине в точке Гинье-Кратки в нормализованной кратки. Если плато достигло первого участка Кратки-Дебье, то образец, скорее всего, удлиненный или гибкий. Если участок SIBYLS сначала плато, то образец, скорее всего, содержит области как компактности и гибкости, частицы со смешанными состояниями. Теория такой гибкости в отношениях с Законом Пород-Дебье изысканно рассматривается в Рэмбо, идр. Нажмите на том. Определение объема должно быть выполнено сразу же после анализа гибкости сверху. При открываемом после анализа гибкости генерируется всплывающее окно с еще тремя графиками. В нижнем, левом углу участок Porod-Debye помнит, где один оставил ползунок от участка гибкости, показывая площадь плато. Чтобы рассчитать объем частицы, переместите стартовые и конечные точки с помощью кнопок стрелки или ввемите в ящики, чтобы синяя линия на участке вписывалась в область плато. Для объективного результата, остатки в правом верхнем Porod-Debye экспонента власти закона подходят, не должны показывать шаблон. Нажмите на вкладку P(r). Распределение в реальном пространстве находится в левой панели и кривой рассеяния для образца в правой панели. Цель состоит в том, чтобы создать реальное представление образца из взаимного пространства кривой SAXS. В идеале кривая распределения будет гладкой без волны настоящее время и должны просто осторожно поцеловать x-оси.ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренный q-диапазон прибора не может быть полностью использован из-за плохого сопоставления буфера, агрегации, радиационного повреждения, неоптимальных времен экспозиции и низких концентраций частиц. Этап определения P(r)будет в корне определять используемый диапазон qmin и qmax набора данных SAXS, и именно этот диапазон данных должен использоваться для любого последующего моделирования или установки. Нажмите правой кнопкой мыши на имя образца, а затем нажмите Найти DMAX, чтобы открыть новое окно. Ограничения для dmax предварительно установлены с предлагаемым qmax (максимальные используемые точки данных), нижними иверхними максимальными ограничениями d и более низким и верхним альфа-баллом. Три модели могут быть выбраны (L1-норма, Legendre и Мур) и использование фона включены. Оставьте их без изменений в первую очередь. Нажмите кнопку “Пуск”. Композитное распределение создается в левой панели с предлагаемым dmax и альфа-уровнем, написанным под ним. Если это выглядит приемлемым, то закройте окно и вернитесь к вкладке P(r). Взаимный участок пространства будет обрезан, чтобы соответствовать предложенному qmax. Выберите модель Moore, нажмите на фон, а затем установите альфа-уровень и dmax к предлагаемым значениям из всплывающего окна. Нажмите кнопку уточнения. Появляется участок перекрестной проверки, показывающий, если какие-либо точки должны были быть отклонены, отмеченные красным цветом. Если есть только несколько точек отклонены и распределение выглядит хорошо, то модель хорошая.ПРИМЕЧАНИЕ: Участок перекрестной проверки будет выделить области данных, которые несовместимы с определяемой P(r)-распределением. Если отвергнутый регион находится главным образом в регионе с низким уровнем q, то есть в регионе, близком к оси, это, вероятно, предполагает dmax, который является слишком коротким, наличие агрегации или олигомеров более высокого порядка. В нем подчеркивается несоответствие между информацией о более высоком и низком разрешении. Здесь dmax и qmin (увеличение значения старта) должны быть скорректированы с помощью ручного подхода проб и ошибок. Аналогичным образом, если отклоненный регион находится главным образом в регионе с высоким q, это может указывать на проблему с фоновым вычитанием или на то, что сигнал слишком слаб, чтобы быть значимо объясненным определяемым распределением P(r).-. В этом случае q max следуетусечен (уменьшение конца) до тех пор, пока не будут отклонены дополнительные данные. В идеале отклоненные точки должны распределяться случайным образом и составить менее 5% от годных к использованию данных. Правильно определенный qmin,qmax и “dmax”будет производить плавное распределение, где dmax целует x-axis. Тем не менее, не увеличивать это значение настолько, что он полностью удаляет регион Guinier. Эта точка легко найти, проверяя q x l (q) поле (слева от панели над таблицей). Кривая рассеяния заменяется “Всего рассеянного участка интенсивности”, на этой кривой все точки до максимального перегиба являются частью области Guinier. После удаления точек попробуйте еще раз увеличить /уменьшить “dmax”,а затем уточнить еще раз. Если проблемы сохраняются, особенно когда многие точки отклоняются с самого начала кривой проверки, это убедительно указывает на то, что данные не идеально подходят для структурного моделирования. Чтобы распечатать отчет, перейдите к вкладке Анализ, слева нажмите, чтобы выделить образец, а затем право нажмите на имя образца и перейти к Созданию отчета из одного набора данных в меню. Открывается текстовый ящик, позволяющий добавить комментарии. Производится документ PDF, показывающий все цифры и значения, генерируемые.