JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

Published: January 28, 2021
doi:
10.3791/61578
, , ,
1European Synchrotron Radiation Facility Structural Biology Group,Structural Biology Group, 2Institut de Biologie Structurale, University Grenoble Alpes, CEA, CNRS, 3Diamond Light Source, 4Laboratoire de Physiologie Cellulaire and Végétale,Université Grenoble Alpes/CNRS/CEA/INRA/BIG

Summary

מדידות SEC-BioSAXS של מקרומולקולות ביולוגיות הן גישה סטנדרטית לקביעת מבנה הפתרון של מקרומולקולות והמתסבינים שלהן. כאן, אנו מנתחים נתוני SEC-BioSAXS משני סוגים של עקבות SEC בדרך כלל – כרומטוגרמות עם פסגות שנפתרו במלואן ונפתרו חלקית. אנו מדגימים את הניתוח ואת ההתפוררות באמצעות פיזור ו- BioXTAS RAW.

Abstract

BioSAXS היא טכניקה פופולרית המשמשת בביולוגיה מולקולרית ומבנית כדי לקבוע את מבנה הפתרון, גודל החלקיקים והצורה, יחס פני השטח לנפח ושינויים קונפורמיים של מקרומולקולות ותסביכים מקרומולקולריים. ערכת נתונים באיכות גבוהה של SAXS עבור מידול מבני חייבת להיות ממונודיספרס, דגימות הומוגניות, ולעתים קרובות מגיעים אליה רק באמצעות שילוב של כרומטוגרפיה מוטבעת ומדידה מיידית של SAXS. בדרך כלל, כרומטוגרפיה של החרגת גודל משמשת להפרדה בין דגימות ולא לכלול מזהמים וצבירות מהחלקיקים של עניין המאפשר מדידות SAXS להיעשות משיא כרומטוגרפי שנפתר היטב של מין חלבון יחיד. עדיין, במקרים מסוימים, אפילו טיהור מוטבע אינו ערובה של דגימות monodisperse, או בגלל רכיבים מרובים קרובים מדי זה לזה בגודל או שינויים בצורה המושרה באמצעות מחייב לשנות את זמן ההתמהמה נתפס. במקרים אלה, ייתכן שיהיה ניתן לפענח את נתוני SAXS של תערובת כדי להשיג את עקומות SAXS אידיאליות של רכיבים בודדים. כאן, אנו מראים כיצד הדבר מושג והניתוח המעשי של נתוני SEC-SAXS מתבצע בדוגמאות אידיאליות וקשות. באופן ספציפי, אנו מראים את ניתוח SEC-SAXS של הפולימראז ה-DNA E9 vaccinia exonuclease מינוס מוטציה.

Introduction

מקרומולקולות ביולוגיות קטנות מכדי שניתן לראותן אפילו עם מיקרוסקופי האור הטובים ביותר. השיטות הנוכחיות כדי לקבוע את המבנים שלהם בדרך כלל כרוכים גביש החלבון או מדידות על מספרים עצומים של מולקולות זהות באותו הזמן. בעוד שהקריסטלוגרפיה מספקת מידע ברמה האטומית, היא מייצגת סביבת דגימה מלאכותית, בהתחשב בכך שרוב המקרומולקולות אינן מוצגות בצורה גבישית בתא. במהלך השנים האחרונות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים נמסר מבנים ברזולוציה גבוהה דומה של מקרומולקולות גדולות / תסביכים מקרומולקולריים, אבל למרות הדגימות קרובות יותר למצב פיזיולוגי, הם עדיין קפואים, ולכן לא נייד וסטטי. פיזור קרני רנטגן בזווית ביו-קטנה (BioSAXS) מספק מדידה מבנית של המקרומולקול, בתנאים הרלוונטיים לביולוגיה. מצב זה ניתן לדמיין כצורה תלת-מית-רזולוציה נמוכה הנקבעת בקנה מידה ננומטר ולוכדת את כל המרחב הקונפורמציה של המקרומולקול בפתרון. ניסויי BioSAXS מעריכים ביעילות מצב אוליגומרי, דומיין וסידורים מורכבים, כמוגם גמישות בין תחומים 1,2,3. השיטה מדויקת, בעיקר לא הרסנית ובדרך כלל דורשת רק מינימום של הכנה וזמן מדגם. עם זאת, עבור הפרשנות הטובה ביותר של הנתונים, הדגימות צריך להיות monodisperse. זה מאתגר; מולקולות ביולוגיות רגישות לעתים קרובות לזיהמים, טיהור וצבירה לקויים, למשל מהקפאת הפשרת4. הפיתוח של כרומטוגרפיה מוטבעת ואחריו מדידה מיידית של SAXS מסייעת למתן תופעות אלה. כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל מפרידה בין הדגימות לפי גודל ובכך אינה כוללת את רוב מזהמים וצבירות5,6,7,8,9,10. עם זאת, במקרים מסוימים אפילו SEC-SAXS אינו מספיק כדי לייצר מדגם monodisperse, כי התערובת עשויה להיות מורכבת מרכיבים קרובים מדי בגודל או המאפיינים הפיזיים שלהם או הדינמיקה המהירה שלהם להוביל לשיאים חופפים במעקב UV SEC. במקרים אלה, שלב פירוק מבוסס תוכנה של נתוני SAXS שהושג עלול להוביל לעקומת SAXS אידיאלית שלהרכיב הבודד 5,11,12. כדוגמה, בפרוטוקול סעיף 2, אנו מראים את הניתוח הסטנדרטי של SEC-SAXS של הפולימראז DNA E9 vaccinia exonuclease מינוס (E9 exoמינוס)במתחם עם DNA. Vaccinia מייצג את האורגניזם מודל של Poxviridae, משפחה המכילה מספר פתוגנים, למשל וירוס אבעבועות שחורות אנושי. הפולימראז הוצג לקשור בחוזקה DNA בגישות ביוכימיות, עם המבנה של המתחם נפתר לאחרונה על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן13.

רוב מתקני הסינכרון יספקו צינור עיבוד נתונים אוטומטי שיבצע נורמליזציה ואינטגרציה של נתונים בהפקת קבוצה של מסגרות לא מנוי. אבל הגישה המתוארת בכתב יד זה יכולה לשמש גם עם מקור מעבדה בתנאי SEC-SAXS מבוצע. יתר על כן, אוטומציה נוספת עשויה להיות זמינה שתדחה מסגרות שניזוקו בקרינה ותבצע חיסור מאגר14. אנו נראה כיצד לבצע ניתוח נתונים ראשי על נתונים מעובדים מראש ולמזל את הנתונים הזמינים בסעיף 2.

בסעיף 3, אנו מראים כיצד לפענח נתוני SEC-SAXS ולנתח את הקימורים ביעילות. אמנם ישנן מספר שיטות deconvolution כגון deconvolution שיא Gaussian, מיושם בארה”ב-SOMO15 ואת שיטת Guinier אופטימיזציה הסבירות המרבית, מיושם בתוכנה DELA16, אלה בדרך כלל דורשים מודל עבור צורת שיא12. הגודל סופי של פסגות בודדות שאנו חוקרים מאפשר את השימוש בניתוח פקטור מתפתח (EFA), כצורה משופרת של ריקבון ערך יחיד (SVD) כדי לפענח פסגות חופפות, מבלי להסתמך על צורת השיא אופיזור פרופיל 5,11. ניתן למצוא יישום ספציפי ל-SAXS ב- BioXTAS RAW17. EFA שימש לראשונה על נתוני כרומטוגרפיה כאשר נתוני מערך דיודה דו-ממדית אפשרו למטריצות להיווצר מספיגה כנגד זמן השמירה ונתוניאורך גל 18. כאשר EFA מצטיין הוא שהוא מתמקד באופי המתפתח של ערכים ייחודיים, איך הם משתנים עם המראה של רכיבים חדשים, עם האזהרה כי יש סדר טבועברכישה 10. למרבה המזל, נתוני SEC-SAXS מספקים את כל נתוני הרכישה הדרושים מסודרים במערכי נתונים 2D מאורגנים, ומשאילים את עצמם יפה לטכניקה של EFA.

בסעיף 4, אנו נדגים את היסודות של ניתוח SAXS עצמאי מודל מהעקומה SAXS חיסור רקע חיסור. ניתוח עצמאי-מודל קובע את רדיוס הגידול של החלקיקים (Rg), נפח המתאם (Vc), נפח פורוד (סמנכ”ל) ומעריך פורוד-דביי (PE). הניתוח מספק הערכה חצי כמותית של המצב התרמודינמי של החלקיקים במונחים של קומפקטיות או גמישות באמצעות מגרש Kratky ללא ממד2,4,19.

לבסוף, נתוני SAXS נמדדים ביחידות חלל הדדיות ואנחנו נראה כיצד להפוך את נתוני SAXS למרחב אמיתי כדי לשחזר את פונקציית ההפצה של מרחק הזוג, P(r). התפלגות P(r) היא ערך של כל המרחקים שנמצאו בתוך החלקיק וכוללת את הממד המרבי של החלקיקים, dmax. מאחר שזאת מדידה תרמודינמית, התפלגות P(r) מייצגת את המרחב הפיזי הכבוש על ידי המרחב הקונפורמציה של החלקיקים. ניתוח נכון של ערכת נתונים של SAXS יכול לספק תובנות מצב פתרון המשלימות מידע ברזולוציה גבוהה מקריסטלוגרפיה ו- cryo-EM.

Protocol

1. ביטוי חלבון, טיהור ומדידה SEC-SAXS מבוסס על הפרוטוקולשפורסם 13 בצע את פרוטוקול איסוף הנתונים של SEC-SAXS (Brennich ואח’6)בקצרה. ערך את עמודת ה-SEC עם לפחות 2 אמצעי אחסון של מאגר פועל של ה-SEC (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl). להכין 50 μL של מדגם של E9 exoמינוס ב 8\u201210 מ”ג/ מ”ל עם 20% עודף טוחנת של dsDNA חלקי (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC ו GGCTAAACCGCTGTTATCTT). E9 exoמינוס נקשר עם KD של 12 ± 6 נה”מ (ראה נתונים משלימים). הזרק 50 μL של תערובת זו לעמודת SEC (S200 להגדיל) בתוך הקו עם תא הזרימה עבור מדידות SAXS ב 0.3 מ”ל/דקה. לאסוף 1000 מסגרות ב 1 s חשיפה כל אחד.הערה: על BioSAXS beamline BM29, במתקן Synchrotron האירופי (ESRF) המסגרות הבודדות מעובדות באופן אוטומטי ובאופן עצמאי במסגרת EDNA14. לאחר איסוף הנתונים, פתח את מסד הנתונים של ספקספק 20 ותחת הכרטיסיה רכישת נתונים לחץ על לחצן עבור כדי לגשת לערך הנתונים ולתוצאות הניתוח האוטומטי21. הורד את הנתונים. 2. ניתוח נתונים ראשי פתיחת התוכנית מבוססת Java פיזור IV (ראה טבלת חומרים) ולבצע חיסור רקע עבור נתוני כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC).פתח את הכרטיסיה SEC. גרור ושחרר את קבצי הנתונים המופחתים (*.dat) לחלון “שחרר נתונים להלן”. הגדר ספריית פלט “Out Dir ::” על-ידי לחיצה על לחצן פלט Dir עם תווית כחולה.הערה: אם הנתונים שלך נאספו ב- nm-1 , יהיה צורךלבדוק תיבת המרה (בפינה הימנית התחתונה של החלונית) בעת שחרור קבצים בחלון או בכרטיסיית החיסור. ערוך את הפרטים הניסיוניים, השתמש בלחצן ערוך פרטים ומלא שדות רבים ככל האפשר, אלה כוללים מקטעים שבהם נעשה שימוש במקור/קו הקרן לאיסוף נתונים, פרמטרי האיסוף ופרטים לדוגמה. אלה יישמרו עם הנתונים ויאפשרו לאכלס בקלות רבה יותר את הסעיף “פרמטרים של איסוף נתונים” בפרסומים עתידיים. הזן את שם הדוגמה בתיבה שמירה בשם. לחץ על מעקב.הערה: לכך יש שני אפקטים. ראשית, הוא ייצור קובץ *.sec עבור הנתונים. זהו קובץ טקסט יחיד שיאסף את כל התצפיות הניסיוניות מקובץ *.dat נפרד. בנוסף, הקובץ *.sec מכיל את קבוצת המסגרות הממוצעת שהיא רקע המאגר, את כל המסגרות המשמשות בממוצע, כמו גם את המסגרות המיותרות ברקע המאגר על-פני כל ניסוי ה- SEC-SAXS. שנית, נוצרת התוויית אות המתווה את מספר המסגרת לעומת יחס אינטגרלי לרקע. פעולה זו מציגה את המסגרות שנבחרו (אפור) שהיו בממוצע עבור חיסור מאגר. הנקודות עבור המאגר הממוצע נקבעות מכל טווח הנתונים. עם זאת, מומלץ לבחור באופן ידני את מסגרות המאגר עבור ממוצע כמו רקע מוגדר היטב עלול להתרחש עקב עמודות לא שוויוניות או מלוכלך או עבירה נימים22. בחר מסגרות מאגר באופן ידני. לחץ על נקה מאגרים ולאחר מכן בחר מחדש אזור מאגר עם לחיצה שמאלית וגרור, בעקומות המעקב. באופן אידיאלי, זה צריך להיות אזור שטוח לפני נפח הריק של עמודת ה-SEC של כ- 100 מסגרות. לחץ על הגדר מאגר ולאחר מכן עדכן כדי לחשב מחדש את הקובץ *.sec שעשוי להימשך מספר דקות. זיהוי אזור מעניין (ROI). על מגרש האות, בחר את האזור של שיא העניין, עם לחיצה שמאלה גרור.הערה: כך מאכלס שלושה קוויוים בחלונית הימנית. שתי העלילות האחרונות מקושרות עם הכוונת הנעות ביניהן, עלילת אות שני (מימין למעלה) מציגה רק את ההחזר על ההשקעה שנבחרה, עם העוצמה של כל מסגרת בכחול וה-Rg המתאים של כל מסגרת באדום ומפת חום מתאימה להלן, המציגה את השאריות עבור כל מסגרת הצבעונית על פי ניתוח המתאם האוטומטי של דורבין-ווטסון. אזורים בעלי דמיון גבוה הם ציאן צבעוני (Durbin-Watson, d = 2) בעוד מסגרות שונות ילכו בלוז כהה יותר לוורודים ולבסוף לאדומים בהתאם לחומרת הדמיון (d > 2). ההתווה התחתונה היא עקומת I לעומת q המנומקת עבור המסגרת המרכזית שנבחרה (מסומנת גם על-ידי קו אנכי). ניתן להשתמש במקשי החצים כדי לנווט בין המסגרות המנומקות. העלילה “אני נגד קיו” תדגים את איכות המסגרות המנומחות מהניסוי של הרשות לניירות ערך. בחר מסגרות למיזוג. לחץ על הכוונת במפת החום כדי לבחור את קבוצת המשנה של מסגרות שישמש למיזוג. הכוונת תזהה אזור משולש של ציאן בעיקרו נופל לצד הימני התחתון של הכוונת. השתמש בלחיצת עכבר כדי להגדיר מסגרות אלה כאפשרות שנבחרה ולסמן את המסגרות באזור המתאים של התוויית האות לעיל. מסגרות אלה אמורות להדגיש באופן אידיאלי אזור עם Rg יציב.הערה: בהתאם לצורך, הגדל את התצוגה של מפת החום באמצעות גרירה והגדלה בלחיצה שמאלית עם החלקה מהירה ימינה בלחיצה שמאלית. כאשר אתה מרוצה מהמסגרות שנבחרו, לחץ על מזג. אפשרות זו תמזג את המסגרות המנוחות ותציג אותן בכרטיסיה ANALYSIS. 3. פירוק נתונים פתח את תוכנית ההתפוררות (לדוגמה, BioXTAS Raw 2.0.0). בתוכנית הפירוק, טען את ערכת הנתונים, תחת הכרטיסיה קבצים, בלוח הבקרה, השתמש בסמל foldether כדי לאתר את הנתונים או להעתיק ולה להדביק את המיקום בשורת הכתובת.הערה: ודא שהתיקיה מכילה רק את קובץ *.dat גולמיים ללא קבצי נתונים מעובדים או ממוצעים. סמן את כל .dat *, לחץ על לחצן סדרת התוויה, עלילה של עוצמה משולבת לעומת מספר מסגרת תצייר ב”מגרש סדרה”. בלוח הבקרה, בחר בכרטיסיה סידרה ולאחר מכן לחץ כדי לסמן את העקומה. פתח את החלון המוקפץ LC Analysis באמצעות הלחצן בבסיס לוח הבקרה. חלון זה מעניק גישה למספר אפשרויות, כגון בחירת סוגי מולקולות שונים (חלבון או RNA). הוא גם מאפשר למשתמש לבחור את אזור המאגר עבור התווייתו. במופע הראשון לחץ על אוטומטי; אפשרות זו אמורה לבחור אזור מאגר מתאים.הערה: אם פעולה זו נכשלת, ייתכן עקב תוכנית בסיסית לא יציבה, אז “הוסף אזור” כדי למטב את אזור המאגר. פעולה זו מאכלסת את התיבה מאגר בתיבה קטנה יותר שבה ניתן להוסיף באופן ידני את מספרי המסגרות לשימוש עבור המאגר. לחלופין, לחץ על “בחר” כדי לתת את האפשרות של בחירת אזור על העלילה. אתר את האזור, לחץ פעם הימנית פעם אחת עבור מיקום ההתחלה, הזז את הסמן למיקום הבא ולחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני. ייתכן שיהיה צורך להוסיף יותר ממיקום מאגר אחד. לחץ על הגדר מאגר והעיקולים יחושבו וה- Rg יחושב על-פני פסגת ה- SEC. אם מופיעה תיבה מוקפץ, לחץ על אישור. כדי להתחיל בניתוח פקטור מתפתח (EFA), לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ המסוגם בתחתית הבקרה ולאחר מכן בחר ה-EFA (EFA) מהתפריט.ודא שנפתח חלון מוקפץ המציג את פירוק הערך היחיד (SVD) של מערכת הנתונים. בתיבה פקדים, סמן את התיבה השתמש במסגרות כך שכל אזור השיא כדי לפענח את השליטה י מכוסה בהתווה העוצמה. העלילה “ערכים ייחודיים”, מימין למעלה, מציגה את עוצמת הערכים הייחודיים (פסגות/מינים נפרדים) מעל לקו הבסיס.הערה: מספר הנקודות הנוכחות מעל לקו הבסיס מייצג את מספר המינים המפוזרים הנוכחיים. עם האזהרה כי זה סדר הגודל היחסי של הערך הייחודי לאזור שטוח / קו הבסיס שחשוב. כדי לסייע באימות מספר הערכים הבודדים, השתמש בהתוויה התחתונה של תיקון שגיאות אוטומטי. זה מראה את וקטורי המתאם הימנית ושמאלית. לחץ על הבא.הערה: אלה מייצגים למעשה פרופילי פיזור או ריכוז עבור הווקטור בפתרון. כאשר הגודל המוחלט מייצג את המשמעות של הווקטור. רכיב משמעותי יהיה יחסים אוטומטיים ליד 1 (כלל של ניתוק אגודל הוא >0.6\u20120.7). RAW מחשב זאת ומוצג בתיבה #Significant, בפינה השמאלית התחתונה, אם כי באפשרותך לשנות זאת במידת הצורך. אם קיימים מספר ערכים בודדים (לדוגמה 4+), ייתכן שיהיה צורך להסתכל רק על 2 או 3 מהרכיבים בלבד, ולשנות את טווח הנתונים המשמשים. נמוך יותר מספר הרכיבים כך ניתוח EFA יהיה קל יותר, אך במחיר השימוש בפחות נתונים. במצב מורכב, שבו וקטורים יחיד שמאל וימין, אשר צריך להיות דומה, אינם תואמים להפחית את מספר SV משמעותי ולהקטין את מספר המסגרות המשמשות עד וקטורים יחיד שמאל וימין דומים. ודא שה- EFA מחושב על-ידי יצירת קוויווח בכיוונים קדימה ואחורה עבור כל וקטור. התוויות אלה מציגות מתי רכיבים מתחילים (התוויה קדימה) ויוצאים (התוויה לאחור) פרופיל הפתרון עבור נתוני SEC-SAXS שנבחרו. RAW מנסה לזהות טווחים אלה; שנה אלה באמצעות החצים לצד המונים כך שכל עיגול יהיה בתחילתה של נקודת גוון העולה מקו הבסיס או נופלת. לחץ על הבא.הערה: השלב האחרון של ה-EFA הופך את הווקטורים SVD בחזרה לעקומת פיזור. בצד שמאל של החלון, הטווחים שהוגדרו קודם לכן מותווים בראש. טווחים אלה הם האילוצים כדי להגדיר היכן לסובב את הווקטורים הייחודיים בחזרה לעקומת פיזור. החלונית הימנית מציגה פרופילי עקומת פיזור תואמים אלה, עבור כל שיא מופרד. עלילה לריכוז של כל שיא, זה צריך להיות נציג של פרופילי אלגנטיות ועלילה לשגיאה ממוצעת משוקלל chi2. העלילהצ’י 2 מודדת את הנתונים deconvolution להגדיר את הנתונים המקוריים. באופן אידיאלי, זה יהיה שטוח, עם זאת קוצים לעתים קרובות ניתן לראות. נסה להפחית או לחסל קוצים על-ידי שינוי פקדי טווח הרכיבים, לזהות תחילה בערך איזו מסגרת מתאימהלספייק (מהתווה chi 2) ולאחר מכן, בפקדי טווח, הרכיב המכיל מסגרת זו (זה יכול להיות יותר מאחד), באמצעות החצים, לנוע למעלה או למטה בטווח המתאים.הערה: הודעה זו אמורה להפיק תגובה, הגדלת או הקטנת העלייה. אם מסגרת הקוצים הייתה קיימת ביותר מרכיב אחד, ייתכן שיהיה צורך בניסוי וטעייה קטן בין כל רכיב. כאשר הושגצ’י 2 מינימלי, בצע בדיקת אימות על-ידי לחיצה חזרה, נראה שהחלון הקודם מאפשר אימות אם השינויים שבוצעו שינו באופן דרסטי את קווי ה- EFA המקוריים. אם הם עדיין נראים חוקיים, לחץ על הבא. לחץ על שמור נתוני EFA כדי לשמור את התוויות ולאחר מכן לחץ על בוצע; כדי לסגור את חלון ה- EFA.הערה: אימות שני הוא ללחוץ על תיבת הסימון לצד כל טווח רכיבים, בתורו. אלה מספקים אילוץ ריכוז חיובי לכל רכיב וכיבוי יבדוק אם אלה משפיעים באופן משמעותי על מערכת הנתונים. אם לא נראה שינוי בחלקת הריכוז אז הנתונים תקפים. בחזרה לחלון RAW, לחץ על הכרטיסיה פרופילים בלוח הבקרה כדי להציג את הקימורים ובכינוי טיפול בלוח הבקרה, לטפל עוד יותר לעקומות או לשמור את הקימורים כקבצי *.dat על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ובחירה לשמור קבצים נבחרים מהתפריט. שמור את הקובץ. השתמש פיזור IV לניתוח נוסף.הערה: מידע נוסף והוראות על deconvolution ו EFA BioXTAS RAW נמצא https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. קביעת מאפייני SAXS הערה: ערכת לימוד מעמיקה לקביעת SAXS נמצאת Bioisis.net. כאן אנו מציגים גישה בסיסית שלב אחר צעד, המדגישה את הלחצנים השימושיים ביותר ב-Scatter. בכרטיסיה ניתוח פיזור, לחץ על לחצן G עבור כלי הניתוח הידני Guinier, מימין לכל קובץ לדוגמה. העלילה שנפתחת מציגה את ה- Lnלעומת q2 במתיבה העליונה ואת המיתרים המתאימים בתיבה התחתונה. הוסף או הסר נקודות כך שלשריות לא תהיה תכונה “חיוך” או “זועף”. הנתונים שנבחרו ב- Guinier fit אינם יכולים לחרוג ממגבלת q x Rg המרבית של 1.3. לחץ על לחצן קראפטקי מנורמל; העלילה שצץ מספק הערכה כמותית למחצה של המצב המבני של macromolecule, מנורמל עבור מסה וריכוז.הערה: הכוונת מציינת את נקודת גנייר-קראפטקי (√3, 1.1)19. חלבון כדורי קומפקטי יראה שיא יחיד עם הערך המרבי בנקודת גנייר-קראקי. ביופולימר מופרע באופן מהותי או גלילי יהיה מקסימום גדול יותר מהכוורשת ולא יקטן. חלבון שהיה לו גם תחומים מקופלים ואזורים ארוכים מוארכים לא מובנים עשוי להציג עם מקסימום מוגבר דרך הכוונת, אבל גם יראה מגמה פוחתת ברורה ב q x Rg גבוה יותר. לחץ על כפתור Vc (עוצמת מתאם), אשר מעלה שתי חלקות, עוצמת המפוזר הכוללת ותחום משולב של עוצמת המפוזר הכולל כפונקציה של q. העלילות משמשות כהפניה מהירה לאימות איכות עקומת הפיזור.הערה: העוצמה המפוזרת הכוללת רגישה ל- I(0) ואם הדבר לא נמדד כראוי, התווייתו לא תצג קו רציף. חלקת האזור המשולבת, באופן אידיאלי, אמורה להציג קו סיגמואידי עם רמה מורחבת עבור כל עקומת SAXS. אם קיימת אי-התאמה/חיסור של מאגר, צבירה או הפרעה בין-מפלגתית בדגימה, יצוין מדרון חד בערכי q גבוהים יותר. לחץ על לחצן גמישות כדי להתחיל בניתוח הגמישות. פעולה זו תפתח חלון עם ארבעה פנלים מחוון בתחתית. כל פאנל פתוח מציג עלילה המנצלת מערכת יחסים של דיני כוח הקיימת בין ביופולימרים קומפקטיים ומוזהרים/גמישים23. כדי להשתמש, הזז את המחוון בתחתית התיבה מימין לשמאל כאשר לחצן העכבר השמאלי לחוץ. להמשיך לנוע לאט שמאלה עד לרמה באחת המגרשים הוא הגיע.הערה: אם הרמה נראית בעלילה Porod-Debye, אז המדגם הוא קומפקטי בטבע, אשר צריך להיות עקבי עם שיא אחד בנקודה Guinier-Kratky בעלילה קראפטקי מנורמל. אם הרמה מגיעה ראשונה בחלקת Kratky-Debye אז המדגם הוא כנראה מוארך או גמיש. אם העלילה SIBYLS היא תחילה לרמה, המדגם ככל הנראה מכיל אזורים של קומפקטיות וגמישות, חלקיק עם מצבים מעורבים. התיאוריה ליחסי גמישות אלה עם חוק פורוד-דביי מטופלת להפליא ברמבו, ואח’23. לחץ על עוצמת הקול. קביעת עוצמת הקול צריכה להתבצע מיד לאחר ניתוח הגמישות מלמעלה. כאשר הוא נפתח לאחר ניתוח הגמישות, נוצר קופץ עם שלושה גרפים נוספים. בפינה התחתונה, בפינה השמאלית, העלילה Porod-Debye זוכרת היכן אחד השאיר את המחוון ממתווה הגמישות, המציג את האזור המיושט. כדי לחשב את אמצעי האחסון של החלקיק, הזז את נקודות ההתחלה והסיום באמצעות לחצני החצים או הקלד בתיבות, כך שהקו הכחול במערך יתאים לאזור המיושט. לתוצאה לא משוחדת, שאריות הימין העליון Porod-Debye מעריך כוח החוק, לא צריך להראות דפוס. הקש על הכרטיסיה P(r). התפלגות החלל האמיתי נמצאת בלוח השמאלי ועיקול הפיזור עבור המדגם בלוח הימני. המטרה היא ליצור ייצוג שטח אמיתי של המדגם מהעקומה של SAXS של החלל ההדדי. באופן אידיאלי, עקומת ההפצה תהיה חלקה ללא גלים נוכחים ואמורים לנשק בעדינות את ציר ה-x.הערה: טווח ה-q הנמדד של המכשיר עשוי שלא להיות שיד לגמרי עקב התאמת מאגר לקויה, צבירה, נזק לקרינה, זמני חשיפה תת-אופטימליים וריכוזי חלקיקים נמוכים. שלב קביעת P(r) יקבע באופן יסודי את הטווח הניתן ל-qmin ו-q max של ערכת הנתונים SAXS, ועליו להיות טווח נתונים זה המשמש עבור מידול או התאמה עוקבים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שם הדוגמה ולאחר מכן לחץ על חפש DMAX כדי לפתוח חלון חדש. המגבלות עבור ה-dמקסימום מוגדרות מראש עם ה-qmax המוצע (נקודות נתונים מרביות בשימוש),מגבלות מקסימום d נמוכות ועליונות וציון אלפא נמוך והעליון. ניתן לבחור שלושה דגמים (L1-norm, Legendre ומור) ואת השימוש ברקע כלול. השאר אותם ללא שינוי במקרה הראשון. לחץ על לחצן התחל. התפלגות מורכבת נוצרת בלוח השמאלי עם רמת dmax ו- alpha המוצעת כתובה מתחת. אם פעולה זו נראית מקובלת, סגור את החלון וחזור אל הכרטיסיה P(r). חלקת החלל ההדדית תחתוך כך שתתאים ל-qmax המוצע. בחר את המודל מור, לחץ על רקע ולאחר מכן הגדר את רמת אלפא dמקסימום לערכים המוצעים מהתיבה המוקפץ. לחץ על לחצן ההעדפה. עלילת אימות צולבת תצוץ ותראה אם יש לדחות נקודות כלשהן, המסומנות באדום. אם יש רק כמה נקודות שנדחו וההפצה נראית טוב אז המודל הוא טוב.הערה: התוויית האימות הצולב תסמן אזורים של הנתונים שאינם תואמים להתפלגות P(r) שנקבעה. אם האזור שנדחה הוא בעיקר באזור Q נמוך, כלומר האזור ליד ציר y, זה כנראה מציע dמקסימום כי הוא קצר מדי, נוכחות של צבירה או אוליגומרים סדר גבוה יותר. הוא מדגיש חוסר עקביות בין מידע ברזולוציה גבוהה יותר לנמוך יותר. כאן, ישלכוונן את dmax ו- q min (הגדלת ערך ההתחלה) באמצעות גישה ידנית של ניסיון וטעייה. באופן דומה, אם האזור שנדחה נמצא בעיקר באזור q גבוה, הדבר עשוי להצביע על בעיה בחיסור הרקע או שהאות חלש מכדי להיות מוסבר באופן משמעותי על-ידי התפלגות P(r) הנחושה. במקרה זה,יש לנקות את q max (הפחתת הקצה) עד שלא יידחו נתונים נוספים. באופן אידיאלי, יש להפיץ באופן אקראי נקודות שנדחו ולהוות פחות מ-5% מהנתונים השימושיים. q min מוגדר כראוי ,q מקסימוםו -“d מקסימום” יפיק התפלגות חלקה שבו dמקסימום מנשק את ציר x. עם זאת, אל תגדיל ערך זה כל כך הרבה שהוא מסיר לחלוטין את אזור Guinier. נקודה זו נמצאת בקלות על-ידי סימון התיבה q x l(q) (בצד שמאל של החלונית שמעל הטבלה). עקומת הפיזור מוחלפת על-ידי “העלילה ‘עוצמה מפוזרת כוללת’, בעקומה זו כל הנקודות לפני שהגוון המקסימום הן חלק מאזור Guinier. לאחר הסרת נקודות לנסות שוב להגדיל / להקטין את “dמקסימום”ולאחר מכן למקד פעם נוספת. אם הבעיות נמשכות, במיוחד כאשר נקודות רבות נדחות מתחילת עקומת האימות, הדבר מצביע על כך שהנתונים אינם אידיאליים עבור מידול מבני. כדי להדפיס דוח, נווט חזרה אל הכרטיסיה ניתוח, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסמן את הדוגמה ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שם הדוגמה ולעבור ליצירת דוח מערכת נתונים בודדת בתפריט. תיבת טקסט נפתחת כדי לאפשר הוספת הערות. מסמך PDF מופק המציג את כל הדמויות והערכים שנוצרו.

Representative Results

היתרון של שימוש deconvolution על בחירתמסגרת קלאסית 13 הוא להסיר את ההשפעה של מינים אחד על השני, לייצר אות פיזור monodisperse. זה גם מלווה לעתים קרובות עם אות טוב יותר יחס רעש. כאשר E9 exoמינוס מאוגד ל-DNA והפעלה באמצעות SEC-SAXS, שתי פסגות נצפו(איור 1). הפסגה הראשונה, הגדולה (כמסגרות 420\u2012475) היא E9exoמינוס -קומפלקס DNA השני (כמסגרות 475\u2012540), המצב הלא מאוגד (ראה נתונים משלימים: איור 2). בעוד הגישה הקלאסית של בחירת מסגרות מספקת Rg יציב של המתחם בשיא הראשון (ראה נתונים משלימים: איור 3),הפסגה השנייה ממוזגת בבירור וה-Rg על פני העלילה מראה כי לשיא השני של עניין אין Rg יציב, בשל זיהום צולב-שיא. רק 5 מסגרות ניתן להשתמש שהראה Rg יציב למחצה, כאשר הפחתה הם נתנו Rg = 36.3 Å(איור 2,ירוק). כאשר הפסגות היו מפותלות באמצעות EFA העקומה המתאימה לשיאהשני (איור 2, כחול) היה מכוסה עם המקורי והראה ירידה ברורה באות לרעש, ו Rg נמוך יותר, 34.1 Å נרשם. העלילה Kratky (איור 3) מראה את המתחם עם הפסגה המפותלת (כחול) הוא יותר כדורי. זה מאושר על ידי עקומת P(r) (איור 4) אשר נותן dמקסימום 108.5 Å עבור העקומה המפותלת (כחול) בעוד שאינו מפותל הוא מוארך יותר עם dמקסימום 120 Å (ירוק), זה ככל הנראה בשל הטרוגניות הנובעת E9 exo לאמאוגד מינוס. איור 1: עלילת אותות של E9 exoמינוס לבד ועם DNA מורכב.החלונית העליונה מציגה חלקה של היחס האינטגרלי לרקע עבור כל מסגרת של הפעלת SEC-SAXS (כחול בהיר). הנקודות האדומות מראות את ה-Rg בכל מסגרת מעל הפסגה. הלוח התחתון מציג את מפת החום המתאימה המציגה את שאריות עבור כל מסגרת צבעונית על פי ניתוח מתאם אוטומטי Durbin-Watson, אזורים בעלי דמיון גבוה הם ציאן צבעוני בעוד מסגרות שונות לעקוב אחר כחול כהה לורודים ולבסוף לאדום בהתאם לחומרת הדמיון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: עלילת עוצמה לעומת וקטור פיזור.שכבת-על של נתוני SAXS המנופחות יוצרת את ה- E9 exominus . בירוק 5 מסגרות (מסגרת 517\u2012522) בממוצע והוחתר מתוך אזור של Rg יציב למחצה ובכחול עקומת פיזור מייצג נגזר EFA deconvolution של שיא SEC-SAXS. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: עקומת קראפטקי ללא מימדים.שכבת-על של עקומת Kratky המפותלת (כחול) ולא מסובבת (ירוקה) המציגה את E9 exoמינוס היא כדורית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: עקומת P(r).שכבת-על של הקימורים המפותלים (כחול) והקימורים הלא-מפותלים (ירוקים) עבור Exo E9מינוס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. נתונים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה 

Discussion

הוא רצוי לקבל דגימת monodisperse לפני תחילת ניסוי SAXS, אבל במציאות, אוספי נתונים רבים אינם מספקים את זה ויש לשפר על ידי שילוב המדידה עם כרומטוגרפיה מוטבעת – SEC ברוב המקרים. עם זאת, גם המחסור בזמן בין טיהור ורכישת נתונים מונו-דיספרסיות של המדגם אינו מובטח. בדרך כלל, הדבר חל על ניסויים שבהם רכיבים קרובים מדי בגודלם או במאפיינים הפיזיים שלהם כדי להיות מופרדים או נוטים לדינמיקה מהירה. כאן, סיפקנו פרוטוקול המשלב ריקבון ערך יחיד עם ניתוח גורם מתפתח כדי להסיר את ההשפעה של DNAbound E9 exoמינוס מהצורה הלא מאוגדת שלה יצירת פרופיל פיזור monodisperse כי לאחר מכן הצלחנו לנתח עם חבילת SAXS פיזור IV.

SVD עם EFA של נתוני SEC-SAXS הן שיטות רבות עוצמה שפותחו כדי לפענח נתוני SAXS ולשפר את הניתוח, אך יש להם מגבלות. הם דורשים שרעש או סחף בקו הבסיס של מאגר ה- SEC-SAXS נשמר למינימום. הדבר עשוי לכלול שיוויון עמודות נוסף (עדיף להשתמש ביותר מ- 3 אמצעי אחסון של עמודות, בהתאם למאגר) לפני טעינה לדוגמה. עם זאת, השלב הקריטי ביותר הוא הבחירה במספר הערכים הייחודיים ומגוון הנתונים בהם נעשה שימוש, מכיוון שזה ישפיע במידה רבה על הדיוק של ההתפוררות. מסיבה זו אין לקחת את התוצאות בעצמן, אלא לנתח אותם עוד יותר באמצעות טכניקות כגון אולטרה-צנטריפוגציה אנליטית (AUC) או פיזור אור לייזר רב-זוויתי (MALLS) לפרשנות ביולוגית.

Scatter IV היא חבילת תוכנה חדשה, ללא תשלום למחקר ולשימוש תעשייתי עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אפילו לא מומחים לנתח את הנתונים שלהם. פיזור IV כולל מספר תכונות חדשות המסייעות לשפר את הניתוח של נתוני SEC-SAXS, כגון מפת החום המקושרת להתווה האות, ומאפשרת דיוק רב יותר עם בחירת מסגרות. בניתוח נתונים ראשי, ניתוח Guinier Peak ומזימת האימות הצולבת המשויכת לניתוח P(r) מציעים יכולת פתרון בעיות משולבת בתוכנה.

יש לציין כי תוכניות רבות אחרות יכולות לשמש לניתוח נתונים ראשי; אלה מכילים את אותן תכונות בסיסיות ומתעדכניםגם באופן קבוע כגון חבילת BIOXTAS RAW 17 ATSAS24 ו- US-SOMO15 כדי לבשם כמה.

אך ללא קשר לחבילת SAXS המשמשת לניתוח, המגבלות העיקריות נפוצות: הכנת המדגם, לפני איסוף וניתוח. בדוגמה E9 exoמינוס המוצגת, ברור לראות את השיפור ביחס האות לרעש ועם הפחתה ב- Rg dmax המשויך לדגימה monodisperse. פעולה זו תסייע מאוד לעיבוד נוסף של הנתונים כגון התאמה או מידול עם מבנים ידועים ברזולוציה גבוהה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכה הכספית עבור הפרויקט מהמענק הצרפתי REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 ועל ידי מענקי מחקר מהשירות דה סנטה דה ארמה וDélégation Générale לשפוך l’Armement. אנו מודים ל-ESRF על זמן קרן ה-SAXS. עבודה זו השתמשה בפלטפורמות של מרכז גרנובל להנחות-אריק (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) בתוך שותפות גרנובל לביולוגיה מבנית (PSB), הנתמכת על ידי פריזבי (ANR-10-INBS-05-02) ו- GRAL, ממומן בתוך בית הספר לתואר שני של אוניברסיטת גרנובל אלפ (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). תוך-כלית מכך ב-IBS מכירה באינטגרציה במכון המחקר הבינתחומי של גרנובל (IRIG, CEA). אנו מודים ל-Wim P. Burmeister ול-Fr é déric Iseni על התמיכה הכספית והמדעית,ואנחנו גםמודים לד”ר ג’סי הופקינס מ-BioCAT ב-APS על עזרתו ועל פיתוח BioXTAS RAW.

Materials

Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
BioXTAS Raw 1.2.3. MacCHESS http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
Scatter Diamond Light Source Ltd http://www.bioisis.net/tutorial/9 Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)
Superdex 200 Increase 5/150 GL column GE Healthcare 28990945 SEC-SAXS column used
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
  2. Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
  3. Gräwert, M., Svergun, D. A beginner’s guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
  5. Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
  6. Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
  7. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
  8. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
  9. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
  10. Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
  11. Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
  12. Maeder, M., Neuhold, Y. M. . Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).
  13. Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  14. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
  15. Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
  16. Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
  17. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
  18. Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
  19. Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
  22. Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
  23. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
  24. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).

Tags

SEC-SAXSEFA DeconvolutionScatterVaccinia Virus DNA PolymeraseBackground SubtractionSize Exclusion ChromatographyMonodispersityMacromoleculeMacromolecular ComplexDeconvolutionData Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tully, M. D., Tarbouriech, N., Rambo, R. P., Hutin, S. Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter. J. Vis. Exp. (167), e61578, doi:10.3791/61578 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image