EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

1. Protein ekspresyonu, saflaştırma ve SEC-SAXS ölçümü yayınlanan protokol13’e dayanmaktadır. Satır içi SEC-SAXS veri toplama protokolünü (Brennich ve ark.6)kısaca izleyin. SEC sütununu en az 2 sütun luk SEC çalışma arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) ile dengeleyin. 8\u201210 mg/mL’de 50 μL E9 exoeksi numunesini parsiyel dsDNA ‘nın molar fazlalığı ile hazırlayın (TCAGGAAGATAACAACAGCGGTTTAGCC ve GGCTAAACCGCTGTTATTT). E9 exoeksi 12 ± 6 nM KD ile bağlanır (Ek Verilerebakın). 0,3 mL/dk’da SAXS ölçümleri için akış hücresi ile bu karışımın 50 μL’sini bir SEC sütununa (S200 Artış) enjekte edin. Her biri 1 s pozlama da 1000 kare toplayın.NOT: BioSAXS ışın hattı BM29’da, Avrupa Senkrotron Tesisi’nde (ESRF) tek tek çerçeveler EDNA çerçevesi14içinde otomatik ve bağımsız olarak işlenir. Veri toplama dan sonra, ISPyB veritabanı20’yi açın ve Veri toplama sekmesinin altında veri kümesine ve otomatik analiz sonuçlarına erişmek için Git düğmesine basın21. Verileri indirin. 2. Birincil veri analizi Java tabanlı programı açın Dağılım IV (bkz. Malzeme Tablosu) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) verileri için bir arka plan çıkarma gerçekleştirin.SEC sekmesini açın. Azaltılmış veri dosyalarını(*.dat)”Verileri Aşağıdaki Bırak” penceresine sürükleyin ve bırakın. Mavi etiketli Output Dir düğmesini tıklatarak çıktı dizini “Out Dir ::” olarak ayarlayın.NOT: Verileriniz nm-1’detoplandıysa, pencereye veya çıkarma sekmesine dosya bırakırken bir dönüşüm kutusunun (panelin sol altta) işaretedilmesi gerekir. Deneysel ayrıntıları düzenleyin, Ayrıntıları Düzenle düğmesini kullanın ve mümkün olduğunca çok alanı doldurun, bunlar veri toplamak için kaynak/ışın çizgisinin kullanıldığı bölümleri, toplama parametrelerini ve örnek ayrıntıları içerir. Bunlar verilerle birlikte kaydedilir ve gelecekteki yayınlarda “Veri toplama parametreleri” bölümünü daha kolay doldurmaya olanak sağlar. Kaydet kutusuna örnek adı girin. TRACE’etıklayın.NOT: Bunun iki etkisi vardır. İlk olarak, veriler için bir *.sec dosyası oluşturur. Bu ayrı * .dat dosyaları tüm deneysel gözlemler harmanlayacak tek bir metin dosyasıdır. Buna ek olarak, *.sec dosyası arabellek arka planı olan ortalama çerçeve kümesini, ortalama da kullanılan tüm çerçeveleri ve tüm SEC-SAXS denemesi boyunca arabellek arka planı çıkarılan çerçeveleri içerir. İkinci olarak, çerçeve numarasını arka plana integral oranına göre çizen bir sinyal çizimi oluşturulur. Bu, arabellek çıkarma için ortalama olarak seçili kareleri (gri) gösterir. Ortalama arabellek için puan veri tüm aralığından belirlenir. Ancak, kötü tanımlanmış bir arka plan kötü dengelenmiş veya kirli sütunlar veya kapiller kirlenme22nedeniyle oluşabilir gibi ortalama için tampon çerçeveleri manuel olarak seçmek için tavsiye edilir. Arabellek çerçevelerini el ile seçin. Arabellekleri Temizle’yi tıklatın ve ardından izleme eğrisinde sol tıklamayla bir arabellek bölgesini yeniden seçin. İdeal olarak, bu yaklaşık 100 kare SEC sütunun geçersiz hacmi önce düz bir bölge olmalıdır. BIRKAÇ dakika sürebilir *.sec dosyasını yeniden hesaplamak için BUFFER’ı AYARLA ve sonra Güncelleştir’i tıklatın. İlgi çekici bir bölge (YG) belirleyin. Sinyal çiziminde, sol tıklamayla ilginin doruğundaki bölgeyi seçin.NOT: Bu, sağ panelde üç çizim ilerler. Üst iki arsalar aralarında hareket crosshairs ile bağlantılıdır, ikinci bir sinyal arsa (sağ üst) sadece Seçilen Yatırım Getirisi gösterir, mavi her çerçevenin yoğunluğu ve kırmızı her çerçevenin ilgili Rg ve aşağıdaki karşılık gelen ısı haritası, Durbin-Watson otomatik korelasyon analizine göre renkli her kare için artıkları gösteren. Benzerlik gösteren bölgeler renkli siyan (Durbin-Watson, d = 2) iken, farklı çerçeveler farklı lıkların şiddetine bağlı olarak koyu mavileri pembelere ve son olarak da kırmızılara kadar takip edecektir (d > 2). Alt çizim, seçilen merkezi çerçeve için çıkarılan I karşı q eğrisidir (dikey bir çizgiyle de gösterilir). Ok tuşları çıkarılan çerçeveler arasında gezinmek için kullanılabilir. I karşı q çizimi, SEC deneyinden çıkarılan çerçevelerin kalitesini gösterir. Birleştirmek için çerçeveleri seçin. Birleştirme için kullanılacak çerçevelerin alt kümesini seçmek için ısı haritası çizimindeki artı işaretine tıklayın. Artı işareti, hedef in sağ alt tarafına düşen ağırlıklı olarak siyan üçgen bir alanı tanımlar. Bu kareleri seçili olarak ayarlamak ve yukarıdaki Sinyal çiziminin ilgili alanındaki çerçeveleri vurgulamak için fare tıklaması kullanın. Bu çerçeveler ideal olarak kararlı bir Rg ile bir bölge vurgulamak gerekir.NOT: Gerektiğinde, ısı haritasını sol tıklatarak yakınlaştırın ve sağa sola kaydırarak uzaklaştırın. Seçili karelerle memnun olduklarında BİrLEŞTİr’itıklatın. Bu, çıkarılan çerçeveleri birleştirir ve BUNLARı ANALYSIS sekmesinde sunar. 3. Veri deconvolution Deconvolution programını açın (örn. BioXTAS Raw 2.0.0). Deconvolution programında, veri kümesini, Dosyalar sekmesi nin altında, Denetim Masası’ndayükleyin, verileri bulmak veya konumu adres çubuğuna kopyalayıp yapıştırmak için katrevi sembolünü kullanın.NOT: Klasörün yalnızca ham *.dat dosyalarını içerdiğinden ve işlenmiş veya ortalama veri dosyaları içermediğinden emin olun. Tüm *.dat dosyalarını vurgulayın, Plot Series düğmesine basın, kare sayısına karşı tümleşik yoğunluklu bir çizim “Seri Çizimi”nde çizilecektir. Denetim Masası’nda Seri sekmesini seçin ve ardından eğriyi vurgulamak için tıklatın. Kontrol panelinin tabanındaki düğmeyi kullanarak LC Analysis açılır penceresini açın. Bu pencere, değişen molekül türlerini (protein veya RNA) seçmek gibi çeşitli seçeneklere erişim sağlar. Ayrıca, kullanıcının çizim için arabellek bölgesini seçmesine de olanak tanır. İlk etapta Otomatik’i tıklatın; bu uygun bir arabellek bölgesi seçmelidir.NOT: Bu, büyük olasılıkla kararsız bir taban çizgisi nedeniyle başarısız olursa, arabellek bölgesini en iyi duruma getirmek için “Bölge Ekle” olur. Bu, arabellek için kullanılacak çerçeve numaralarını el ile ekleyebileceği daha küçük bir kutuyla Arabellek kutusunu doldurur. Alternatif olarak, arsa üzerinde bir alan seçme seçeneği vermek için “Seç” seçeneğini tıklatın. Alanı bulun, başlangıç konumu için bir kez sol tıklatın, imleci bir sonraki konuma taşıyın ve tekrar sol tıklatın. Birden fazla arabellek konumu eklemek gerekebilir. Arabelleği Ayarla’yı tıklatın ve eğriler çıkarılır ve RG SEC zirvesi boyunca hesaplanır. Açılır pencere kutusu görünüyorsa, Tamam’ıtıklatın. Gelişen Faktör Analizi’ni (EFA) başlatmak için, en alttaki vurgulanan dosyaya sağ tıklayın Kontrol Paneli ve sonra seçin Efa menüden.Veri kümesinin tek değer ayrışmasını (SVD) gösteren bir açılır pencerenin açılıp açılmadığını denetleyin. Denetimler kutusunda, deconvolute için tüm tepe alanı yoğunluk çizimi kaplı olacak şekilde Çerçeveler kullanın kutusunu işaretleyin. Sağ üstteki “Tekil Değerler” çizimi, taban çizgisinin üzerindeki tekil değerlerin (ayrı zirveler/türler) yoğunluğunu gösterir.NOT: Taban çizgisinin üzerinde bulunan nokta sayısı, mevcut saçılma türlerinin sayısını temsil eder. Bu uyarı ile önemli olan düz alan / taban çizgisi için tekil değeri göreli büyüklüğüdür. Tek değer sayısını doğrulamaya yardımcı olmak için, alttaki AutoCorrelation çizimini kullanın. Bu, sağ ve sol tek korelasyon vektörlerini gösterir. İleri’yitıklatın.NOT: Bunlar temelde çözeltideki vektör için dağılım veya konsantrasyon profillerini temsil eder. Mutlak boyutun vektörün önemini temsil ettiği yer. Önemli bir bileşen 1’e yakın bir otokorelasyona sahip olacaktır (başparmak kesme kuralı >0.6\u20120.7’dir). RAW bunu yararlı bir şekilde hesaplar ve gerekirse bunu değiştirebilirsiniz, ancak sol alttaki #Significant SVs kutusunda gösterilir. Birden fazla tek değer (örn. 4+) varsa, kullanılan verilerin aralığını değiştirerek yalnızca bileşenlerin yalnızca 2 veya 3’üne bakmak gerekebilir. Bileşenlerin sayısı ne kadar düşükolursa, EFA çözümlemesi de o kadar kolay olur, ancak daha az veri kullanma pahasına. Benzer olması gereken sol ve sağ tekil vektörlerin anlamlı SV sayısını azaltmaması ve sol ve sağ tekil vektörler benzer olana kadar kullanılan kare sayısını azaltması karmaşık bir durumda. EFA’nın her vektör için ileri ve geri yönde çizimler oluşturarak hesaplanıp hesaplanmadığını denetleyin. Bu çizimler, bileşenlerin seçili SEC-SAXS verilerinin çözüm profilini başlattığını (ileri çizim) ve çıkış (geriye doğru çizim) gösterir. RAW bu aralıkları tanımlamaya çalışır; sayaçların yanındaki okları kullanarak bunları değiştirin, böylece her daire taban çizgisinden yükselen veya taban çizgisine düşen bir çekim noktasının başlangıcındadır. İleri’yitıklatın.NOT: EFA’nın son aşaması SVD vektörlerini saçılma eğrilerine geri döndürer. Pencerenin solunda, daha önce tanımlanan aralıklar en üstte çizilir. Bu aralıklar, tekil vektörlerin saçılma eğrilerine geri döndürülecek yeri tanımlamak için gereken kısıtlamalardır. Sağ el paneli, ayrılan her tepe noktası için bu karşılık gelen saçılma eğrisi profillerini gösterir. Her tepekonsantrasyonu için bir arsa, bu elution profilleri ve ortalama hata ağırlıklı chi2için bir arsa temsilcisi olmalıdır . Chi2 çizimi, deconvolution veri kümesini orijinal veri kümesine göre ölçüyor. İdeal olarak, bu düz olacak, ancak sivri sık sık görülebilir. Bileşen Aralığı Denetimlerideğiştirerek ani artışları azaltmaya veya ortadan kaldırmaya çalışın, önce hangi çerçevenin başak (chi2 çiziminden) karşılık geldiğini belirleyin ve ardından, hangi bileşenin bu çerçeveyi içerdiği (birden fazla olabilir), okları kullanarak ilgili aralığı yukarı veya aşağı taşıyın.NOT: Bu, artış veya başak azalan bir yanıt üretmelidir. Başak çerçevesi birden fazla bileşende mevcutsa, her bileşen arasında küçük bir deneme ve hata gerekebilir. En az chi2 elde edildiğinde, geritıklayarak bir doğrulama denetimi gerçekleştirin , yapılan değişikliklerin orijinal EFA çizimlerini büyük ölçüde değiştirip değiştirmediğini doğrulamaya izin veren önceki pencere görüntülenir. Hala geçerli görünüyorlarsa, İleri’yitıklatın. Çizimleri kaydetmek için EFA Verilerini Kaydet’i tıklatın ve ardından Bitti’yitıklatın; EFA penceresini kapatmak için.NOT: İkinci bir doğrulama, sırayla her bileşen aralığının yanındaki onay kutusunu kapatmaktır. Bunlar her bileşen için pozitif bir konsantrasyon kısıtlaması sağlar ve kapatma, bunların veri kümesini önemli ölçüde etkileyip etkilemediğini denetler. Konsantrasyon çiziminde herhangi bir değişiklik görülmüyorsa, veriler geçerli olur. RAW penceresinde, eğrileri görüntülemek için Denetim Masası’ndaki Profiller sekmesini ve Denetim Masası’nın Manipülasyon sekmesini tıklatın, eğrileri daha fazla değiştirin veya dosyaya sağ tıklayarak ve menüden seçili dosyayı(lar) kaydet’i seçerek eğrileri *.dat dosyaları olarak kaydedin. Dosyayı kaydedin. Daha fazla analiz için Scatter IV’i kullanın.NOT: Deconvolution ve EFA BioXTAS RAW hakkında daha fazla bilgi ve talimatlar https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. SAXS özelliklerini belirleme NOT: Bioisis.net’da SAXS tayini için ayrıntılı bir öğretici bulunur. Burada, Scatter’teki en kullanışlı düğmeleri vurgulayarak adım adım yaklaşımla temel bir adım gösteriyoruz. Scatter ANALYSIS sekmesinde, her örnek dosyanın sağındaki manuel Guinier çözümleme aracı için G düğmesine basın. Açılan çizim, üst kutudaki q2’ye karşılık ln[I(q) ve alt kutudaki karşılık gelen artıkları gösterir. Artıkların “gülümseme” veya “kaş çatma” özelliği ne olacak gibi noktalar ekleyin veya kaldırın. Guinier uyumunda seçilen veriler maksimum q x Rg limitini 1.3’ü aşmamalıdır. Normalleştirilmiş Kratky düğmesine basın; ortaya çıkan çizim, makromolekülün kütle ve konsantrasyon için normalleştirilmiş yapısal durumunun yarı nicel bir değerlendirmesini sağlar.NOT: Artı işareti Guinier-Kratky noktasını (√3, 1.1)19olarak belirtir. Kompakt, küresel protein Guinier-Kratky noktasında maksimum değeri ile tek bir tepe gösterecektir. Bir özünde düzensiz veya silindirik biyopolimer artı daha büyük bir maksimum olurdu ve azalma olmaz. Hem katlanmış etki alanları ve uzun uzatılmış yapılandırılmamış bölgelere sahip bir protein, artı işareti ile maksimum artışla ortaya çıkabilir, hem de daha yüksek q x Rg’de belirgin bir düşüş eğilimi gösterebilir. İki çizimi, toplam dağınık yoğunluğu ve toplam dağınık yoğunluğun tümleşik alanını q işlevi olarak ortaya çıkaran Vc düğmesine (Korelasyon Hacmi) tıklayın. Çizimler, saçılma eğrisinin kalitesini doğrulamak için hızlı bir başvuru olarak kullanılır.NOT: Toplam dağınık yoğunluk I(0) duyarlıdır ve bu doğru ölçülmemişse, çizim sürekli bir çizgi göstermez. Entegre alan arsa, ideal olarak, her SAXS eğrisi için genişletilmiş bir plato ile bir sigmoidal çizgi göstermelidir. Örnekte arabellek uyuşmazlığı/çıkarma varsa, toplama veya ara parçacık paraziti daha yüksek q-değerlerinde keskin bir eğim gözlenir. Esneklik çözümlemesi başlatmak için Esneklik düğmesine basın. Bu dört panel ve alt kısmında bir kaydırıcı ile bir pencere alacaktır. Her açılan panel kompakt ve uzun / esnek biyopolimerler23arasında var olan bir güç-hukuk ilişkisi istismar bir arsa gösterir. Kullanmak için, sol fare düğmesine basıldığında kutunun altındaki kaydırıcıyı sağdan sola doğru hareket ettirin. Arsalardan birinde bir plato ulaşılana kadar yavaşça sola doğru hareket edin.NOT: Plato Porod-Debye arsa görülürse, o zaman örnek normalleştirilmiş kratky arsa Guinier-Kratky noktada tek bir tepe ile tutarlı olmalıdır doğada kompakt. Plato kratky-Debye arsa ilk ulaşılırsa o zaman örnek büyük olasılıkla uzatılmış veya esnek. SIBYLS çizimi ilk platoya ise, örnek büyük olasılıkla hem kompaktlık hem de esneklik alanları içerir, karışık durumları olan bir parçacık. Porod-Debye Yasası ile bu esneklik ilişkisi için teori zarif Rambo, ve ark23 ele alınmıştır Birim’etıklayın. Birim belirleme, yukarıdan esneklik analizinden hemen sonra yapılmalıdır. Esneklik çözümlemesi sonrasında açıldığında, üç grafik daha içeren bir açılır pencere oluşturulur. Alt köşede, sol köşede Porod-Debye arsa nerede bir esneklik arsa kaydırıcı sol hatırlar, platolu alanı gösteren. Parçacığın hacmini hesaplamak için, ok düğmelerini kullanarak başlangıç ve bitiş noktalarını hareket ettirin veya çizimdeki mavi çizgi yaylalı bölgeye sığacak şekilde kutulara yazın. Tarafsız bir sonuç için, sağ üst Porod-Debyent üst güç yasası uygun artıkları, hiçbir desen göstermelidir. P(r) sekmesine basın. Gerçek alan dağılımı sol panelde ve sağ paneldeki örnek için saçılma eğrisindedir. Amaç, karşılıklı alan SAXS eğrisinden örneğin gerçek alan temsilini oluşturmaktır. İdeal olarak, dağıtım eğrisi hiçbir dalga mevcut pürüzsüz olacak ve sadece yavaşça x-ekseni öpmek gerekir.NOT: Cihazın ölçülen q-aralığı, kötü tampon eşleştirmesi, toplama, radyasyon hasarı, alt-optimal maruz kalma süreleri ve düşük partikül konsantrasyonları nedeniyle tamamen kullanılamayabilir. P(r)-tayini adımı, SAXS veri setinin kullanılabilir qmin ve qmax aralığını temelden belirleyecek ve sonraki modelleme veya montaj için kullanılan bu veri aralığı olmalıdır. Örnek adı sağ tıklatın sonra yeni bir pencere açmak için DMAX’ı Bul’u tıklatın. Dmax limitleri önerilen qmax (maksimal veri noktaları), alt ve üst dmax limitleri ve alt ve üst alfa skoru ile önceden ayarlanır. Üç model (L1-norm, Legendre ve Moore) ve arka plan kullanımı dahil seçilebilir. İlk etapta bu değişmeden bırakın. Başlat düğmesine basın. Sol panelde önerilen dmax ve alfa düzeyi nin altında yazılı bir bileşik dağılım oluşturulur. Bu kabul edilebilir görünüyorsa, pencereyi kapatın ve P(r) sekmesine dönün. Karşılıklı uzay arsa önerilen qmaxmaç için kırpılmış olacak . Model Mooreseçin , Arka Plan tıklayın ve sonra açılır kutusundan önerilen değerlere alfa düzeyi ve dmax ayarlayın. İncele düğmesine basın. Herhangi bir noktanın reddedilmesi, kırmızı ile işaretlenmiş olması durumunda bir çapraz doğrulama çizimi açılır. Reddedilen sadece birkaç nokta varsa ve dağıtım iyi görünüyorsa, model iyidir.NOT: Çapraz doğrulama çizimi, belirlenen P(r)-dağılımıyla tutarsız olan verilerin bölgelerini vurgular. Reddedilen bölge esas olarak düşük q bölgesinde, yani y eksenine yakın bölgede yse, bu büyük olasılıkla çok kısa bir dmax, toplama veya daha yüksek sıra lı oligomerlerin varlığını göstermektedir. Daha yüksek ve daha düşük çözünürlükteki bilgiler arasındaki tutarsızlığı vurgular. Burada, dmax ve qmin (artan başlangıç değeri) manuel, deneme-yanılma yaklaşımı kullanılarak ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, reddedilen bölge esas olarak yüksek q bölgesindeyse, bu arka plan çıkarmayla ilgili bir soruna işaret edebilir veya sinyalin belirlenen P(r)-dağılımı yla anlamlı bir şekilde açıklanamayacak kadar zayıf olduğunu gösterebilir. Bu durumda, ek veri reddedilene kadar qmax kesilir (azalan sonu) gerekir. İdeal olarak, reddedilen puanlar rasgele dağıtılmalı ve kullanılabilir verilerin %5’inden azını oluşturuyorolmalıdır. Düzgün tanımlanmış qmin, qmax ve “dmax” dmax x eksenini öptüğü düzgün bir dağılım üretecektir. Ancak, tamamen Guinier bölge kaldırır bu değeri çok artma. Bu nokta q x l(q) kutusunu işaretleyerek (masanın üzerindeki panelin solunda) kolayca bulunur. Saçılma eğrisi “Toplam Dağınık Yoğunluk çizimi” ile değiştirilir, bu eğride maksimum çekim guinier bölgesinin bir parçası olmadan önce tüm noktalar yer alır. Noktaları çıkardıktan sonra “dmax” artırmak /azaltmak ve sonra bir kez daha rafine tekrar deneyin. Sorunlar devam ederse, özellikle doğrulama eğrisinin başından itibaren birçok nokta reddediliyorsa, bu veriler yapısal modelleme için ideal olmadığını güçlü bir şekilde gösterir. Bir rapor yazdırmak için, Analiz sekmesine geri gidin, örneği vurgulamak için sol tıklatın, ardından örnek adına sağ tıklayın ve menüdeki tek veri kümesinden rapor oluştur’a taşıyın. Yorumların eklenmesine izin vermek için bir metin kutusu açılır. Oluşturulan tüm rakamları ve değerleri gösteren bir PDF belgesi oluşturulur.