قياسات SEC-BioSAXS للجزيئات الحيوية البيولوجية هي نهج قياسي لتحديد هيكل الحل للجزيئات الكبيرة ومجمعاتها. هنا، نقوم بتحليل بيانات SEC-BioSAXS من نوعين من آثار SEC التي تمت مواجهتها عادةً – الكروماتوجرامات ذات القمم التي تم حلها بالكامل وتم حلها جزئيًا. نحن نبرهن على التحليل وفك الفولت باستخدام مبعثر وBioXTAS RAW.
BioSAXS هي تقنية شائعة تستخدم في البيولوجيا الجزيئية والهيكلية لتحديد بنية الحل وحجم الجسيمات وشكلها ونسبة السطح إلى الحجم والتغيرات التكينية للجزيئات الكبيرة والمجمعات الجزيئية. يجب أن تكون مجموعة بيانات SAXS عالية الجودة للهندسة الهيكلية من عينات أحادية اللون ومتجانسة ، وغالبًا ما يتم الوصول إلى هذا فقط عن طريق مزيج من الكروماتوغرافيا المضمن وقياس SAXS الفوري. والأكثر شيوعاً، يستخدم اللوني اقصائي الحجم لفصل العينات واستبعاد الملوثات والتجميعات من الجسيمات ذات الأهمية، مما يسمح بإجراء قياسات SAXS من ذروة الكروماتوغرافية محسومة بشكل جيد من نوع بروتين واحد. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، حتى التنقية المضمنة ليست ضمانة لعينات أحادية الdisdisperse ، إما لأن مكونات متعددة قريبة جدًا من بعضها البعض في الحجم أو تغييرات في الشكل تحدث من خلال وقت التجلي المُلِمِم المُبَرَك. وفي هذه الحالات، قد يكون من الممكن إلغاء بيانات SAXS من الخليط للحصول على منحنيات SAXS المثالية للمكونات الفردية. هنا، نُظهر كيف يتم تحقيق ذلك، ويتم إجراء التحليل العملي لبيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة في SAXS على عينات مثالية وصعبة. على وجه التحديد، نعرض تحليل SEC-SAXS لمولمر الحمض النووي (E9) المتجنح E9 مُسَلِق مُسَوَّر ناقص متحول.
الجزيئات الحيوية البيولوجية صغيرة جداً بحيث لا يمكن رؤيتها حتى مع أفضل المجاهر الخفيفة. الأساليب الحالية لتحديد هياكلها تنطوي عموما على بلورة البروتين أو القياسات على أعداد كبيرة من الجزيئات متطابقة في نفس الوقت. بينما البلورية توفر معلومات عن المستوى الذري، فإنه يمثل بيئة العينة الاصطناعية، نظراً لأن معظم الجزيئات الكبيرة لا تقدم في شكل بلوري في الخلية. خلال العامين الماضيين المجهر الإلكترونات cryo تسليم مماثلة هياكل عالية الدقة من الجزيئات الكبيرة / مجمعات الجزيئات الكبيرة، ولكن على الرغم من أن العينات هي أقرب إلى الحالة الفسيولوجية، فهي لا تزال مجمدة، وبالتالي غير متحركة وثابتة. بيولوجيا صغيرة زاوية الأشعة السينية تشتت (BioSAXS) يوفر قياسا هيكليا من الجزيئات ، في الظروف التي هي ذات الصلة البيولوجيا. ويمكن تصور هذه الحالة كشكل منخفض الدقة 3-D يحدد على مقياس نانومتر ويلتقط كامل الفضاء التشكلي من الجزيئات في الحل. تجارب BioSAXS تقيم بكفاءة الدولة القلة ، والمجال والترتيبات المعقدة ، فضلا عن المرونة بين المجالات1،2،3. الطريقة دقيقة، ومعظمها غير مدمرة وعادة ما يتطلب سوى الحد الأدنى من إعداد العينة والوقت. ومع ذلك، للحصول على أفضل تفسير للبيانات، يجب أن تكون العينات أحادية. وهذا أمر صعب؛ وغالبا ما تكون الجزيئات البيولوجية عرضة للتلوث، وضعف تنقية وتجميع، على سبيل المثال من تجميد ذوبان4. ويساعد تطور الكروماتوغرافيا المضمن متبوعاً بقياس SAXS الفوري على التخفيف من هذه الآثار. يفصل اللوني بين الحجم و الاستثناءات العينات حسب الحجم وبالتالي يستبعد معظم الملوثات والتجميعات5و6و7و8و9و10. ومع ذلك، في بعض الحالات، حتى لجنة الأوراق المالية والبورصة-SAXS لا تكفي لإنتاج عينة أحادية، لأن الخليط قد يتكون من مكونات قريبة جداً من حيث الحجم أو خواصها الفيزيائية أو دينامياتها السريعة تؤدي إلى قمم متداخلة في أثر الأشعة فوق البنفسجية لـ SEC. في هذه الحالات، قد يؤدي خطوة deconvolution المستندة إلى البرامج من بيانات SAXS التي تم الحصول عليها إلى منحنى SAXS مثالي مكونفردي 5و11و12. على سبيل المثال، في قسم البروتوكول 2، نعرض تحليل SEC-SAXS القياسي لمولمرات الحمض النووي vaccinia E9 exonuclease ناقص متحولة (E9 exoناقص)في معقدة مع الحمض النووي. يمثل Vaccinia الكائن الحي النموذجي لـ Poxviridae ، وهي عائلة تحتوي على العديد من مسببات الأمراض ، على سبيل المثال فيروس الجدري البشري. وقد تبين أن البوليميراز يرتبط بإحكام إلى الحمض النووي في النهج الكيميائية الحيوية، مع هيكل مجمع حلها مؤخرا من قبل التصوير البلوري بالأشعة السينية13.
وسيوفر معظم مرافق السنكروترون خط أنابيب معالجة البيانات الآلي الذي سيقوم بتطبيع البيانات والتكامل لإنتاج مجموعة من الإطارات غير المubted. لكن النهج الموصوف في هذه المخطوطة يمكن استخدامه أيضاً مع مصدر مختبر شريطة أن يتم تنفيذ لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS. علاوة على ذلك، قد تتوفر أتمتة إضافية التي سوف ترفض الإطارات التالفة الإشعاع وتنفيذ الطرحالعازلة 14. وسوف نعرض كيفية إجراء تحليل أولي للبيانات التي تم تجهيزها مسبقاً والاستفادة القصوى من البيانات المتاحة في القسم 2.
في القسم 3، نعرض كيفية إلغاء بيانات SEC-SAXS وتحليل المنحنيات بكفاءة. في حين أن هناك العديد من أساليب فك الاحتقان مثل فك الاستئصال ذروة غاوسي، نفذت في الولايات المتحدة-سومو15 وغوييه الأمثل طريقة الاحتمال الأقصى، التي نفذت في برنامج DELA16، وهذه تتطلب عموما نموذجا لشكل الذروة12. حجم محدود من القمم الفردية التي نحقق فيها يسمح باستخدام تحليل عامل متطور (EFA)، كشكل محسن من قيمة المفرد التحلل (SVD) لdeonvolute قمم المتداخلة، دون الاعتماد على شكل الذروة أو تشتت الملف5،11. ويمكن الاطلاع على تطبيق SAXS محددة في BioXTAS الخام17. وقد استخدم التعليم للجميع لأول مرة على بيانات الكروماتوغرافيا عندما سمحت بيانات صفيف ثنائي ثنائي 2D بتكوين المصفوفات من الامتصاص مقابل وقت الاحتفاظ ببيانات الطول الموجي18. حيث تتفوق التعليم للجميع هو أنه يركز على الطابع المتطور للقيم المفردة ، وكيف تتغير مع ظهور مكونات جديدة ، مع التحذير من أن هناك ترتيبًا متأصلًا في الاستحواذ10. لحسن الحظ ، لجنة الأوراق المالية والبورصة – SAXS البيانات توفر جميع البيانات اللازمة المطلوبة في نظم 2D البيانات الصفائف ، الإقراض نفسه بشكل جيد لتقنية التعليم للجميع.
في القسم 4، سوف نبرهن على أساسيات تحليل SAXS المستقل من منحنى SAXS الخاص بالنموذج من منحنى SAXS المطروح من المخزن المؤقت. يحدد التحليل المستقل للنموذج نصف قطر الجيوحد (Rg) وحجم الارتباط (Vc) وحجم Porod (Vp) وPorod-Debye Exponent (PE). التحليل يوفر تقييما شبه كمي للجسيمات في حالة الديناميكا الحرارية من حيث الإحكام أو المرونة عبر مؤامرة كراتكي الأبعاد2,4,19.
وأخيراً، تُقاس بيانات SAXS بوحدات فضائية متبادلة، وسنبين كيفية تحويل بيانات SAXS إلى مساحة حقيقية لاستعادة وظيفة التوزيع بين الزوجين والمسافة P(r). توزيع P(r) هو مجموعة من جميع المسافات الموجودة داخل الجسيمات ويشمل أقصى البعد للجسيمات، دماكس. وبما أن هذا القياس هو قياس دينامي حراري، فإن توزيع P(r) يمثل المساحة الفيزيائية التي يشغلها الفضاء التكتّني للجسيمات. يمكن أن يوفر التحليل السليم لمجموعة بيانات SAXS رؤى الحالة الحل التي تكمل المعلومات عالية الدقة من البلورات و cryo-EM.
من المرغوب فيه أن يكون عينة أحادية قبل بدء تجربة SAXS، ولكن في الواقع، العديد من مجموعات البيانات لا تلبي هذا ويجب تحسينه من خلال الجمع بين القياس مع الكروماتوغرافيا مضمنة -لجنة الأوراق المالية والبورصة في معظم الحالات. ومع ذلك، حتى النقص في الوقت بين تنقية وحيازة البيانات أحادية العينة غير مضمونة. وينطبق ذلك بشكل أكثر شيوعًا على التجارب التي تكون فيها المكونات قريبة جدًا من حيث الحجم أو في خصائصها الفيزيائية بحيث لا يمكن فصلها أو تكون عرضة للديناميكية السريعة. هنا ، قدمنا بروتوكول يجمع بين قيمة واحدة التحلل مع تحليل عامل متطور لإزالة تأثير E9 E9 DNAboundناقص من unbound خلق أحادية التشتت التشكيل الجانبي التي كنا قادرين على تحليل مع حزمة SAXS مبعثر الرابع.
SVD مع EFA من بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS هي طرق قوية جدا وضعت لإلغاء البيانات SAXS وتحسين التحليل، ولكن لديهم قيود. وهي تتطلب أن يتم الاحتفاظ بالضوضاء أو الانجراف في خط الأساس العازل لـ SEC-SAXS إلى أدنى حد. قد يتضمن هذا توازن عمود إضافي (أفضل لاستخدام أكثر من 3 وحدات تخزين عمود، اعتماداً على المخزن المؤقت) قبل تحميل العينة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي اختيار عدد القيم المفردة ونطاق البيانات المستخدمة، لأن هذا سيؤثر بشكل كبير على دقة فك الفولت. ولهذا السبب لا ينبغي أن تؤخذ النتائج من تلقاء نفسها ولكن مزيد من التحليل باستخدام تقنيات مثل الطرد التحليلي فائق التركيز (AUC) أو تشتت ضوء الليزر متعدد الزاوية (MALLS) للتفسير البيولوجي.
مبعثر الرابع هو جديد ، حزمة البرمجيات ، مجانا للأبحاث والاستخدام الصناعي مع واجهة مستخدم بديهية التي تسمح حتى غير الخبراء لتحليل بياناتهم. يحتوي Scatter IV على العديد من الميزات الجديدة التي تساعد على تحسين تحليل بيانات SEC-SAXS ، مثل الخريطة الحرارية المرتبطة بمؤامرة الإشارة ، مما يتيح دقة أكبر مع اختيار اختيار الإطار. في تحليل البيانات الأولية، يقدم تحليل “جينييه الذروة” و”مؤامرة التحقق من الصحة عبر” المرتبطة بتحليل P (r) إمكانية متكاملة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في البرنامج.
وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام العديد من البرامج الأخرى لتحليل البيانات الأولية؛ هذه تحتوي على نفس الميزات الأساسية ويتم تحديثها بانتظام مثل BioXTAS RAW17 ATSAS حزمة24 و US-SOMO15 على سبيل المثال لا الحصر.
ولكن بغض النظر عن أي حزمة SAXS تستخدم للتحليل ، فإن القيود الرئيسية شائعة: إعداد العينة ، قبل الجمع والتحليل. في E9exo المثال ناقص هو مبين، فمن الواضح أن نرى التحسن في نسبة الإشارة إلى الضوضاء ومع انخفاض في Rgالحد الأقصى د المرتبطة عينة monodisperse. وهذا سيساعد كثيرا على زيادة معالجة البيانات مثل تركيب أو نمجة مع الهياكل المعروفة عالية الدقة.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نعترف بالدعم المالي للمشروع من المنحة الفرنسية REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 والمنح البحثية من دائرة سانتيه دي أرميز وDélégation Générale pour l’Armement. ونحن ممتنون لESRF لوقت شعاع SAXS. استخدم هذا العمل منصات مركز غرونوبل للتعليم ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) ضمن شراكة غرونوبل لعلم الأحياء الهيكلي (PSB)، بدعم من FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) وGRAL، بتمويل من جامعة Grenoble Alpes كلية الدراسات العليا (إيكولز Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). يقر IBS بالاندماج في معهد أبحاث غرونوبل متعدد التخصصات (IRIG, CEA). نشكر ويم ب. بورمايستر وFrédéric Iseni على الدعم المالي والعلمي ونشكر أيضًا الدكتور جيسي هوبكنز من BioCAT في APS على مساعدته وتطوير BioXTAS RAW.
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |