Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

La criopreservación se ha convertido en un paso clave de las técnicas de reproducción asistida (AT). En los seres humanos, permite la preservación de la fertilidad o el aplazamiento de la paternidad por razones médicas o personales. En animales, es necesario superar la distancia y el tiempo en apareamientos planificados, especialmente en animales de granja y mascotas, o preservar material genético de sujetos valiosos en programas de conservación, particularmente en especies silvestres en peligro de extinción. La criopreservación de gametos es la mejor opción cuando los individuos a criar aún no han sido elegidos o para evitar problemas éticos asociados con la congelación de embriones, especialmente en la medicina humana¹. Los espermatozoides son relativamente fáciles de preservar y dan resultados satisfactorios después de la descongelación, pero los ovocitos, debido a sus características estructurales, podrían ser más complejos de almacenar. De hecho, la baja relación superficie/volumen, así como la presencia de la zona pellucida que rodea el ooplasma, limita el movimiento de crioprotectores y agua a través de la célula^2. Además, en los animales domésticos, incluidos los feminidos, se caracterizan por un citoplasma rico en lípidos, que se cree que los hace más sensibles a la criopreservación³.

La mayoría de los fetas están amenazados, y el gato doméstico se utiliza como modelo para desarrollar protocolos para la preservación del germoplasma gracias a la disponibilidad de gónadas de la ovariectomía de rutina. En animales salvajes, las gónadas se pueden obtener después de cirugías electivas o (más frecuentemente) se pueden recuperar gametos post morteme inmaduros (vesícula germinal). La estimulación hormonal destinada a obtener ovocitos maduros (metafase II) no es tan común como en los ÁRT humanos debido a las cuestiones éticas y a la respuesta específica de las especies e individuos a los tratamientos⁴.

Por lo tanto, el desarrollo de estrategias de criopreservación se ha centrado en los gametos inmaduros, que generalmente se pueden recuperar después de la muerte inesperada o repentina de individuos raros. Desde un punto de vista biológico, hay algunas diferencias en la criopreservación de gametos inmaduros o maduros, cada uno con sus ventajas. En primer lugar, el ADN está más protegido en ovocitos inmaduros, cuya vesícula germinal contiene cromosomas rodeados por una membrana nuclear, mientras que el husillo meótico de los ovocitos metafase II podría ser más vulnerable a los criocinitos⁵. En segundo lugar, los daños por citoesqueleto inducidos por el frío pueden afectar la rotación del husillo, la extrusión del cuerpo polar, la migración pronuclear y la citoquinesis, que podrían tener diferentes impactos según la fase de desarrollo de los ovocitos, influyendo en la progresión de la meiosis o en eventos posteriores a la fertilización. Por último, y tal vez lo más importante, mientras que los ovocitos maduros están listos para ser fertilizados, los gametos inmaduros confían en el apoyo de las células cúmulos circundantes para pasar por la maduración nuclear y citoplasma^6,y esta es la razón por la que los complejos cúmulos-oocitos (COC) enteros son criopreservados. Sin embargo, la pérdida de células cúmulos y/o la pérdida de conexión funcional entre el gameto y las células somáticas circundantes son probablemente el efecto más perjudicial de la criopreservación de COCs inmaduros.

Entre las técnicas de criopreservación, la vitrificación es una que se puede aplicar más fácilmente en condiciones de campo. En comparación con la congelación lenta (o de velocidad controlada), la vitrificación es más rápida y no requiere equipos específicos, como un congelador programable. Con el fin de satisfacer los tres principios fundamentales de la vitrificación (es decir, alta viscosidad, conectado a alta concentración crioprotectora, pequeños volúmenes y disminución ultrarráptica de la temperatura), varios medios y soportes especialmente se han desarrollado y utilizado en gatos tanto para ovocitos inmaduros como maduros. A partir de pajitas simples⁷, los dispositivos se desarrollaron para alcanzar el objetivo de “Volumen mínimo”. Cryoloop⁸, pajitas abiertas (OPS)⁹, canalones de plástico (paja modificada)¹⁰ y criotubos¹¹ se han utilizado, hasta que se emplee un dispositivo más eficiente (es decir, Cryotop)¹¹, mejorando la supervivencia y la reanudación de la meiosis. Cryotop(Figura Suplementaria 1) es un soporte disponible comercialmente que se ha convertido en el sistema abierto electivo para la vitrificación. Desarrollado para la vitrificación de ovocitos y embriones humanos, consiste en una pequeña tira de película unida a un soporte de plástico duro, protegido por una tapa de tubo de plástico durante el almacenamiento^12. Gracias a su facilidad de uso y a la extrema reducción del volumen de vitrificación (tan solo 0,1 l), lo que también conduce a tasas de enfriamiento y calentamiento extremadamente rápidas, este soporte de vitrificación se ha aplicado cada vez más en varias especies, incluido el gato doméstico, en el que se ha utilizado con una variedad de medios^{13,,14,,15,,16,,17}.

El propósito de este manuscrito es describir un protocolo de calentamiento de la vitrificación de colección, con pequeñas modificaciones del desarrollado originalmente para ovocitos humanos, que emplea medios de laboratorio y soportes comerciales para la vitrificación de volumen mínimo y se puede aplicar fácilmente en condiciones de campo para la criopreservación de COC felinos inmaduros.