Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.
Abstract
Nos programas de conservação de animais silvestres, o gamete banking é crucial para salvaguardar os recursos genéticos de indivíduos valiosos e espécies raras e promover a preservação da biodiversidade. Em felids, a maioria das espécies está ameaçada de extinção, e raças domésticas são usadas como modelo para aumentar a eficiência dos protocolos para o banco de germoplasma. Entre as técnicas de criopreservação oócito, a vitrificação é cada vez mais popular na reprodução assistida humana e veterinária. A vitrificação crioto, que foi inicialmente desenvolvida para oócitos e embriões humanos, demonstrou ser adequada para oócitos de gatos. Este método oferece diversas vantagens, como a viabilidade em condições de campo e a velocidade do procedimento, que pode ser útil quando várias amostras precisam ser processadas. No entanto, a eficiência depende fortemente das habilidades do operador, sendo necessária a padronização intra e interseção de laboratório, bem como o treinamento de pessoal. Este protocolo descreve a vitrificação de volume mínimo de oócitos felinos imaturos em um suporte comercial em um protocolo passo a passo amigável ao campo, da coleta de oócitos ao aquecimento. Seguindo o protocolo, preservação da integridade do oócito e viabilidade no aquecimento (até 90%) pode-se esperar, embora ainda haja espaço para melhorias no amadurecimento pós-aquecimento e resultados de desenvolvimento embrionário.
Introduction
A criopreservação tornou-se um passo fundamental das técnicas de reprodução assistida (ARTs). Em humanos, permite a preservação da fertilidade ou adiamento da paternidade por razões médicas ou pessoais. Em animais, é necessário superar a distância e o tempo em acasalamentos planejados, especialmente em animais de fazenda e animais de estimação, ou preservar material genético de indivíduos valiosos em programas de conservação, particularmente em espécies selvagens ameaçadas de extinção. A criopreservação gamete é a melhor escolha quando os indivíduos a serem criados ainda não foram escolhidos ou a fim de evitar questões éticas associadas ao congelamento de embriões, especialmente na medicina humana1. Espermatozoides são relativamente fáceis de preservar e dar resultados satisfatórios após o descongelamento, mas os oócitos, devido às suas características estruturais, podem ser mais complexos de armazenar. De fato, a baixa relação superfície/volume, bem como a presença da zona pellucida em torno do ooplasma, limita o movimento dos crioprotetores e da água através da célula2. Além disso, em animais domésticos, incluindo felídeos, eles são caracterizados por um citoplasma rico em lipídios, que é pensado para torná-los mais sensíveis à criopreservação3.
A maioria dos felídeos estão ameaçados, e o gato doméstico é usado como modelo para desenvolver protocolos de preservação de germoplasma graças à disponibilidade de gôndas da ovariectomia de rotina. Em animais selvagens, as gônadas podem ser obtidas após cirurgias eletivas ou (mais frequentemente) pós-mortem, e gametas imaturos (vesícula germinal) podem ser recuperados. A estimulação hormonal destinada à obtenção de oócitos maduros (metafase II) não é tão comum quanto nos ARTs humanos devido às questões éticas e à resposta específica da espécie e individual aos tratamentos4.
Portanto, o desenvolvimento de estratégias de criopreservação tem focado em gametas imaturos, que geralmente podem ser recuperados após a morte inesperada ou súbita de indivíduos raros. Do ponto de vista biológico, há algumas diferenças na criopreservação de gametas imaturos ou maduros, cada um tendo suas vantagens. Em primeiro lugar, o DNA é mais protegido em oócitos imaturos, cuja vesícula germinal contém cromossomos cercados por uma membrana nuclear, enquanto o fuso meiotic de oócitos metafase II poderia ser mais vulnerável aos crioinjuutos5. Em segundo lugar, os danos causados pelo citoesqueleto induzido a frio podem afetar a rotação do fuso, extrusão do corpo polar, migração pronuclear e citocinese, que podem ter diferentes impactos de acordo com a fase de desenvolvimento do oócito, influenciando a progressão da meiose ou eventos pós-fertilização. Finalmente, e talvez o mais importante, enquanto os oócitos maduros estão prontos para serem fertilizados, os gametas imaturos contam com o apoio das células cumulus circundantes para passar pela maturação nuclear e citoplasmática6, e esta é a razão pela qual todos os complexos cumulus-oócitos (COCs) são criopreservados. No entanto, a perda de células cumulus e/ou a perda de conexão funcional entre o gamete e as células somáticas circundantes são provavelmente o efeito mais prejudicial da criopreservação de COCs imaturos.
Entre as técnicas de criopreservação, a vitrificação é uma que pode ser aplicada mais facilmente em condições de campo. Em comparação com o congelamento lento (ou taxa controlada), a vitrificação é mais rápida e não requer equipamentos específicos, como um freezer programável. Para satisfazer os três princípios fundamentais da vitrificação (ou seja, alta viscosidade, ligada à alta concentração crioprotetora, pequenos volumes e diminuição da temperatura ultrarrápida), vários meios de comunicação e suportes têm sido desenvolvidos e usados especialmente em gatos para oócitos imaturos e maduros. Começando com canudossimples 7, os dispositivos foram então desenvolvidos para atingir a meta de “volume mínimo”. Cryoloop8, canudos abertos puxados (OPS)9,calhas plásticas (palha modificada)10 e criotubos11 foram utilizados, até que um dispositivo mais eficiente (ou seja, Cryotop) foi empregado11, melhorando a sobrevivência e a retomada da meiase. Cryotop (Figura Suplementar 1) é um suporte comercialmente disponível que se tornou o sistema aberto eletivo para vitrificação. Desenvolvido para a vitrificação de oócitos e embriões humanos, consiste em uma pequena tira de filme presa a um suporte plástico duro, protegido por uma tampa de tubo de plástico durante o armazenamento12. Graças à sua usabilidade e à redução extrema do volume de vitrificação (apenas 0,1 μL), o que também leva a taxas de resfriamento e aquecimento extremamente rápidas, esse suporte de vitrificação tem sido cada vez mais aplicado em várias espécies, incluindo o gato doméstico, no qual tem sido usado com uma variedade de mídia13,14,,15,,16,,17.
O objetivo deste manuscrito é descrever um protocolo de coleta-vitrificação-aquecimento, com pequenas modificações daquela originalmente desenvolvida para oócitos humanos, que emprega mídias de laboratório e suportes comerciais para vitrificação de volume mínimo e pode ser facilmente aplicada em condições de campo para a criopreservação de COCs felinos imaturos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A criopreservação de oócito é uma técnica crucial de conservação do germoplasma, especialmente em taxas onde muitas espécies estão ameaçadas de extinção, como a família Felidae. Neste manuscrito, foi apresentado um protocolo simples e amigável para a vitrificação de oócitos imaturos de gatos. Os meios de comunicação laboratoriais, suportes mínimos de vitrificação de volume e pessoal treinado são os fatores-chave para o sucesso deste método, o que permite a obtenção de oócitos viáveis de forma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e pela Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Também queremos agradecer à Dra.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
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