Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur minimalen Volumenverglasung unreifer Katzenoozyten mit im Labor hergestellten Medien auf kommerziellen Trägern. Es deckt jeden Schritt von der Eizellenisolierung von ex vivo Gonaden bis zur Verglasung und Erwärmung ab.
Abstract
In den Erhaltungsprogrammen für Wildtiere ist Das Gamete Banking von entscheidender Bedeutung, um die genetischen Ressourcen wertvoller Individuen und seltener Arten zu schützen und die Erhaltung der biologischen Vielfalt zu fördern. Bei Feliden sind die meisten Arten vom Aussterben bedroht, und heimische Rassen werden als Modell verwendet, um die Effizienz von Protokollen für das Keimplasma-Banking zu erhöhen. Unter den Eizellen-Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung in der humanen und tierärztlichen assistierten Reproduktion immer beliebter. Die Cryotop-Verglasung, die zunächst für menschliche Eizellen und Embryonen entwickelt wurde, hat sich als gut für Katzenoozyten geeignet erwiesen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie die Machbarkeit unter Feldbedingungen und die Geschwindigkeit des Verfahrens, die hilfreich sein können, wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen. Die Effizienz hängt jedoch stark von den Fähigkeiten des Bedieners ab, und es sind eine labor- und laborübergreifende Standardisierung sowie eine Personalschulung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt minimale Volumen verglasung von unreifen Katzenoozyten auf einer kommerziellen Unterstützung in einem Schritt für Schritt feldfreundliches Protokoll, von der Oozytensammlung bis zur Erwärmung. Nach dem Protokoll, Erhaltung der Oozytenintegrität und Lebensfähigkeit bei Erwärmung (bis zu 90%) zu erwarten, obwohl es noch Raum für Verbesserungen bei der Reifung nach der Erwärmung und den Ergebnissen der embryonalen Entwicklung gibt.
Introduction
Die Kryokonservierung ist zu einem wichtigen Schritt der assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) geworden. Beim Menschen, Es ermöglicht die Erhaltung der Fruchtbarkeit oder Verschiebung der Elternschaft aus medizinischen oder persönlichen Gründen. Bei Tieren ist es notwendig, Distanz und Zeit in geplanten Paarungen zu überwinden, insbesondere bei Nutztieren und Haustieren, oder genetisches Material wertvoller Subjekte in Naturschutzprogrammen, insbesondere in wildgefährdeten Arten, zu konservieren. Gamete Kryokonservierung ist die beste Wahl, wenn die Individuen gezüchtet wurden noch nicht ausgewählt oder um ethische Fragen im Zusammenhang mit embryo nieren, vor allem in der Humanmedizin zu vermeiden1. Spermatozoen sind relativ einfach zu erhalten und geben zufriedenstellende Ergebnisse nach dem Auftauen, aber Eizellen, aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften, könnte komplexer zu speichern. Tatsächlich begrenzt das niedrige Oberflächen-Volumen-Verhältnis sowie das Vorhandensein der Zona-Pellucida, die das Ooplasma umgibt, die Bewegung von Kryoprotektoren und Wasser über die Zelle2. Darüber hinaus sind sie bei Haustieren einschließlich Feliden durch ein lipidreiches Zytoplasma gekennzeichnet, das3sie empfindlicher gegenüber Kryokonservierung 3 machen soll.
Die meisten Felide sind bedroht, und die Hauskatze wird als Modell verwendet, um Protokolle zur Erhaltung von Keimplasma zu entwickeln, dank der Verfügbarkeit von Gonaden aus der routinemäßigen Ovariektomie. Bei Wildtieren können Gonaden nach Wahloperationen oder (häufiger) post-mortemgewonnen werden, und unreife (keimförmige Vesikel) Gameten können geborgen werden. Hormonelle Stimulation, die darauf abzielt, reife (Metaphase II) Eizellen zu erhalten, ist aufgrund der ethischen Fragen und der art- und individualspezifischen Reaktion auf Behandlungen4nicht so häufig wie in menschlichen ARTs.
Daher hat sich die Entwicklung von Kryokonservierungsstrategien auf unreife Gameten konzentriert, die in der Regel nach dem unerwarteten oder plötzlichen Tod seltener Personen abgerufen werden können. Aus biologischer Sicht gibt es einige Unterschiede in der Kryokonservierung von unreifen oder reifen Gameten, von denen jeder seine Vorteile hat. Erstens ist die DNA in unreifen Eizellen geschützt, deren Keimbläschen Chromosomen enthält, die von einer Kernmembran umgeben sind, während die meiotische Spindel der Metaphase II Oozyten anfälliger für Kryoverletzungen sein könnte5. Zweitens können kaltinduzierte Zytoskelettschäden die Spindelrotation, die Polarkörperextrusion, die pronukleare Migration und die Zytokinese beeinflussen, die je nach Oozytenentwicklungsphase unterschiedliche Auswirkungen haben und die Meioseprogression oder Ereignisse nach der Befruchtung beeinflussen. Schließlich, und vielleicht am wichtigsten, während reife Oozyten zur Befruchtung bereit sind, verlassen sich unreife Gameten auf die Unterstützung der umgebenden Cumuluszellen, um durch die kernnukleare und zytoplasmatische Reifung6zu gehen, und dies ist der Grund, warum ganze Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) kryokonserviert sind. Der Verlust von Cumuluszellen und/oder der Verlust der funktionellen Verbindung zwischen der Gamete und den umgebenden somatischen Zellen sind jedoch wahrscheinlich die schädlichste Wirkung der Kryokonservierung unreifer COCs.
Unter den Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung eine, die leichter unter Feldbedingungen angewendet werden kann. Im Vergleich zum langsamen (oder kontrollierten) Einfrieren ist die Verglasung schneller und erfordert keine spezifischen Geräte, wie z. B. einen programmierbaren Gefrierschrank. Um die drei Grundprinzipien der Vitrifizierung (d.h. hohe Viskosität, verbunden mit hoher Kryoprotektorkonzentration, geringen Volumina und ultraschnellem Temperaturabfall) zu erfüllen, wurden mehrere Medien und Stützen entwickelt und insbesondere bei Katzen für unreife und reife Oozyten verwendet. Ausgehend von einfachen Strohhalmen7wurden dann Geräte entwickelt, um das Ziel “Minimum Volume” zu erreichen. Cryoloop8, offen gezogene Strohhalme (OPS)9, Kunststoffrinnen (modifiziertes Stroh)10 und Kryotubes11 wurden verwendet, bis ein effizienteres Gerät (d.h. Cryotop) eingesetzt wurde11, verbesserungder Überleben und Meiose Wiederaufnahme. Cryotop (Supplemental Figure 1) ist eine kommerziell erhältliche Unterstützung, die das wahloffene System für die Vitrifizierung geworden ist. Entwickelt für die Verglasung von menschlichen Eizellen und Embryonen, besteht es aus einem kleinen Folienstreifen, der an einem Hartplastikhalter befestigt ist, geschützt durch eine Kunststoffrohrkappe während der Lagerung12. Dank ihrer Verwendbarkeit und der extremen Reduzierung des Verglasungsvolumens (nur 0,1 l), die auch zu extrem schnellen Abkühlungs- und Erwärmungsraten führt, wurde diese Verglasungsunterstützung zunehmend bei mehreren Arten angewendet, einschließlich der Hauskatze, bei der sie mit einer Vielzahl von Medien13,14,15,16,17verwendet wurde.
Der Zweck dieses Manuskripts ist es, ein Sammlungs-Vitrifizierungs-Erwärmungsprotokoll zu beschreiben, mit geringfügigen Änderungen von dem ursprünglich für menschliche Eizellen entwickelten Protokoll, das im Labor hergestellte Medien und kommerzielle Stützen für minimale Volumenverglasung verwendet und leicht unter Feldbedingungen für die Kryokonservierung unreifer feliner COCs angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte Kryokonservierung ist eine entscheidende Keimplasma-Konservierungstechnik, vor allem in Taxa, wo viele Arten gefährdet sind, wie Felidae Familie. In diesem Manuskript wurde ein einfaches und feldfreundliches Protokoll zur Verglasung unreifer Katzenoozyten vorgestellt. Labormittel, minimale Volumenverglasungsstützen und geschultes Personal sind die Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieser Methode, die es ermöglicht, lebensfähige Eizellen konsequent und wiederholt zu erhalten, wie die repräsentativen Ergebniss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 und von der Université degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Wir danken auch Dr. MariaGiorgia Morselli für ihren Beitrag zu den hierdargestellten Experimenten und zur Bildaufnahme.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
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