미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화
Summary
이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.
Abstract
야생 동물의 보존 프로그램에서 gamete 뱅킹은 귀중한 개인과 희귀 종의 유전 자원을 보호하고 생물 다양성 보존을 촉진하는 데 매우 중요합니다. 고양이에서, 대부분의 종은 멸종 위협, 국내 품종은 세균 은행 프로토콜의 효율성을 높이기 위해 모델로 사용된다. 난염 극저온 보존 기술 중, 유리화는 인간과 수의학 지원 생식에서 점점 더 인기가 있습니다. 인간 난모세포와 배아를 위해 처음 개발된 극저온 상체화는 고양이 난모세포에 적합하다는 것을 입증했습니다. 이 방법은 여러 샘플을 처리해야 할 때 유용할 수 있는 현장 조건의 타당성 및 절차 속도와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 그러나 효율성은 작업자의 기술에 크게 의존하며, 실험실 간 표준화와 인력 교육이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소 수집에서 온난화에 이르기까지 단계별 필드 친화적 인 프로토콜에 의해 단계적으로 상업적 지원에 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화를 설명합니다. 프로토콜에 따라 온난화시 난낭 무결성 및 생존 가능성 보존(90%까지 높음) 온난화 후 성숙과 배아 발달 결과에 개선을 위한 여지가 여전히 남아 있지만, 예상될 수 있습니다.
Introduction
냉동 보존은 보조 재생 기술 (ARTs)의 핵심 단계가되었습니다. 인간에서는, 그것은 의학 또는 개인적인 이유로 부모의 불임 또는 연기의 보존을 허용합니다. 동물에서는 계획된 짝짓기, 특히 농장 동물과 애완 동물에서 거리와 시간을 극복하거나 특히 야생 멸종 위기에 처한 종의 보존 프로그램에서 귀중한 과목의 유전 물질을 보존할 필요가 있습니다. Gamete 냉동 보존은 사육할 개인이 아직 선택되지 않았거나 배아 동결과 관련된 윤리적 문제를 피하기 위해 선택되지 않았을 때, 특히 인간 의학1에서최선의 선택입니다. 정자는 해동 후 비교적 보존하고 만족스러운 결과를 제공하기 쉽지만, 구조적인 특징으로 인해 난모세포는 보관하기가 더 복잡할 수 있습니다. 실제로, 낮은 표면/부피 비뿐만 아니라 우플라즈마를 둘러싼 조나 펠루치다의 존재는 셀2를가로지르는 극저온 보호제와 물의 이동을 제한한다. 또한, 골뚜껑을 포함한 국산 동물에서는 지질이 풍부한 세포질이 특징이며, 이는 냉동 보존3에더 민감하게 반응할 것으로 생각된다.
대부분의 고양이는 위협을 받고 있으며, 국내 고양이는 일상적인 ovariectomy에서 생식샘의 가용성 덕분에 세균 보존을위한 프로토콜을 개발하는 모델로 사용됩니다. 야생 동물에서는, 생식강은 선택적 수술 후 또는 (더 자주) 사후 사후후에 얻을 수 있고, 미숙한 (발아 소포) 게임테스는 회수될 수 있습니다. 성숙한 (담수 II) 난모세포는 치료4에대한 윤리적 문제와 종 및 개별별 반응으로 인해 인간 ART에서와 같이 일반적이지 않다.
따라서, 냉동 보존 전략의 개발은 일반적으로 희귀 한 개인의 예기치 않거나 갑작스런 죽음 후 검색 할 수있는 미숙한 게임에 초점을 맞추고있다. 생물학적 관점에서, 미숙하거나 성숙한 게임족의 냉동 보존에 약간의 차이가 있습니다. 첫째, DNA는 미성숙 한 난모세포에서 더 보호되며, 발아 소포에는 핵 막으로 둘러싸인 염색체가 포함되어 있으며, 메타 위 II 난우세포의 메이오틱 스핀들 (meiotic spindle)은 극저온 부상5에더 취약 할 수 있습니다. 둘째, 냉으로 유발된 사이토스켈레톤 손상은 척추 회전, 극지 체압, 핵 이동 및 사이토카네시스에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 난소 세포 발달 단계에 따라 다른 영향을 미칠 수 있으며, 이는 메이오시스 진행 또는 후 수정 사건에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 아마도 가장 중요한 것은, 성숙한 난모세포가 수정될 준비가 되어 있는 반면, 미숙한 게임들은 핵과 세포질성숙6을통과하기 위해 주변 적혈구의 지원에 의존하며, 이것이 전체 적혈구-오낭복합체(COC)가 극저온보존되는 이유입니다. 그러나, 적혈구의 손실 및/또는 게임및 주변 체세포 사이 기능적인 연결의 손실은 아마 미숙한 COCs의 극저온 보존의 가장 해로운 효력일 것입니다.
극저온 보존 기술 중, 진동은 필드 조건에서 더 쉽게 적용 할 수있는 하나입니다. 느린(또는 제어 속도) 동결에 비해, 유리화는 빠르며 프로그래밍 가능한 냉동고와 같은 특정 장비가 필요하지 않습니다. 유리화의 세 가지 기본 원칙(즉, 높은 점도, 높은 극저온 보호 농도, 소량 및 초고속 온도 감소)을 충족시키기 위해, 여러 미디어와 지지는 특히 미숙하고 성숙한 난모세포 모두에 대해 고양이에서 개발및 사용되었습니다. 간단한 빨대7로시작하여 장치가 개발되어 “최소 볼륨”목표에 도달했습니다. Cryoloop8,오픈 풀기 빨대 (OPS)9,플라스틱 배수구 (수정 된 빨대)10 및 냉동 튜브(11)가 사용되었으며, 보다 효율적인 장치 (즉, Cryotop)가11을고용하여 생존 및 메이오시스 재개를 개선하였다. 극저온(보충도1)은시험신화를 위한 선택개방 시스템이 된 시판지원이다. 인간 난모세포와 배아의 유리화를 위해 개발된 이 스트립은 단단한 플라스틱 홀더에 부착된 작은 필름 스트립으로 구성되어 있으며, 저장12에서플라스틱 튜브 캡에 의해 보호된다. 사용효과와 매우 빠른 냉각 및 온난화 율로 이어지는 유리화 부피(0.1 μL 만큼 약간)의 극단적인 감소덕분에, 이 병신 지원은 다양한 미디어,13,,14,15,16,17로사용되고 있는 국내 고양이를 포함한 여러 종에서 점점 더 많이 적용되고있다.,
이 원고의 목적은 수집 -유리화 온난화 프로토콜을 설명하는 것입니다, 원래 인간의 난모세포에 대해 개발 된 것에서 사소한 수정, 이는 실험실 만든 미디어 및 최소 볼륨 유리화에 대한 상업 지원을 고용하고 미숙한 고양이 COC의 냉동 보존을위한 필드 조건에서 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오키테 냉동 보존은 특히 펠리대 가족과 같이 많은 종들이 멸종 위기에 처한 택시에서 중요한 세균 보존 기술입니다. 이 원고에서는 미숙한 고양이 난모세포의 유리화를 위한 간단하고 현장 친화적인 프로토콜이 제시되었습니다. 실험실에서 만든 미디어, 최소 볼륨 바이트화 지원 및 훈련 된 인력은이 방법의 성공을위한 핵심 요소이며, 이는 실행 가능한 난모세포를 일관되고 반복적으로 얻을 수…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 EVSSAR에 의해 지원되었다 (작은 동물 재생을위한 유럽 수의학 협회) 그랜트 2016 및 Università degli Studi 디 밀라노, 피아노 디 소스테그노 알라 Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A)에 의해 지원되었다. 또한 마리아조르지아 모셀리 박사가 이 실험에 기여한 것에 대해 감사드리며, 이미지 수집에 기여하고 자합니다.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
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