בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו באישור האתי של משרד הבריאות האיטלקי והטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת השימוש (אישור נ. 83/2019-PR). בעלי החיים שמרו במתקן מורשה בבית החולים סן רפאלה, מילאנו, איטליה (הסמכה נ. נ. 127/2012-א). 1. ניתוח שרירים ותרבית סיבים הכנת ציוד. לפני תחילת ההכנות, הכינו את כל הפתרונות הנחוצים כמתואר בטבלה 1. הפתרונות האלה צריכים להיות מוכנים טרי. לנקות את כל המשטחים וכלים שישמשו במהלך ההליך עם 70% אתנול. לפני תחילת הקורבנות עכברים, לבצע ציפוי של 100 מ”מ ו 35 מ”מ מנות פטרי באמצעות סרום סוס (HS). מעילים את כל הכלים כדי למנוע מסיבים לצרף את הפלסטיק. שקול להשתמש בצלחת 1 100 מ”מ ו 4 35 מ”מ מנות לכל עכבר. לאחר הסרת עודפי HS, יש לאחסן מנות מצופות בחממה ב-37 ° c למשך 30 דקות. לאחר מכן מלאו אותו בתמיסת כביסה או באמצעי תרבות (מנות 2 35 מ”מ לכל עכבר).הערה: לחילופין, ניתן להשתמש בתמיסה של 10% HS במדיום של מבנה העיט (DMEM) השונה ביותר עבור מנות משותפות. . תמיד תשתמש בכלים מצופים ניתן להשתמש במנות תרבות בגודל שונה, אך מומלץ לעשות שימוש במידות מנות פטרי. עבור בידוד סיבים, הכינו פיפטות פסטר סטריליים, כפי שמוצג באיור 2. עבור כל עכבר להכין חור אחד גדול נשא פיפטה לטיפול בשריר ופירוק מכני (איור 2A) ואחד צינורות חור קטן עבור בחירת סיבים (איור 2a). חותכים כל אחד מצינורות הזכוכית, ואולי משתמשים בעט ביהלום, לאורך הרצוי ולקצות הפיפטה החלקים בלהבה. מעיל כל פיפטה על ידי הרטבת אותו בקצרה עם HS לפני השימוש. הקרבת עכבר וניתוח שרירים חמם מראש את פתרון העיכול בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני תחילת הליך הניתוח. מיכלי פוליפרופילן FACS עגולים התחתון הם המכולות המתאים ביותר למטרה. מיד לפני תחילת אחזור שרירים, להקריב את העכבר על פי המלצה לאומית IACUC לאומי. רטוב הגוף התחתון עם 70% אתנול לפני חיתוך העור כדי להפוך את ההסרה של השיער קל. לשים את העכבר בתנוחה נוטה על תמיכה של פוליסטירן מכוסה נייר אלומיניום וחותכים את העור החל מאמצע longitudinally בגב ובכיוון של הרגליים. הסירו בזהירות את העור מבלי לגעת בשרירים ובגידים. . אפשר לקרוע את כל העור חותכים את שתי הרגליים של העכבר ולהמשיך במהירות עם הקרע.הערה: אם הוא נוח יותר, ניתן להמשיך את הניתוח על העכבר כולו, אך העבודה על הרגל מאפשרת יותר ניידות ודיוק בחתכים המאוחרים יותר. תקן את הרגל על התמיכה ברמה של כף הרגל באמצעות סיכה ולהתחיל בידוד שרירי השלד של העניין בסדר זה: TA, אדי, הגנקמיוס והסוליה. הרם את הגיד התחתון של TA עם פינצטה חדה בגובה הקרסול וחותכים אותו, ולאחר מכן חותכים עם מספריים עדינים בכל רחבי שריר TA לגיד אחרים ברמה של צלחית (איור 3a). . העבר לפתרון העיכול הרם את הגיד התחתון של אדי והפרד אותו משרירים אחרים על ידי המשך בעדינות למעלה עד לגיד האחר. חותכים ומניחים אותו לתוך פתרון העיכול.הערה: מאחר שאדי עשוי להיות קטן מאוד לקיצוץ בנפרד מ-TA, ניתן לגזור אותם יחד (איור 3B). אז, אם השריר כולו הוא גדול מדי, לחתוך אותו 2-3 חתיכות החל גיד ובעקבות סיבים בכיוון האורך (איור 3C). לסובב את הרגל מראה את השרירים האחורי ולתקן את הרגל באמצעות סיכה. הרימו את גיד האכילה , והוא נפרד באופן אוטומטי משרירים אחרים. הגיד העליון נמצא. בחלק האחורי של הפטלה חותכים אותו ומוסיפים את השריר לעיכול. הרם את גיד הרגל החיצוני (ביחס לגוף) וקבל את הסוליה. בעדינות להפריד אותו מן השרירים האחרים על ידי גלילה מתחת עם הטוויצר. עשה את אותו הדבר עבור הרגל השנייה (צעדים מ1.2.7 ל1.2.11.). שריר העיכול מודנת את פתרון העיכול המכיל את כל השרירים באמבט מים ב 37 ° c עבור כ 45-50 דקות. בזמן העיכול, בודקים בקביעות את השריר כדי להימנע מעיכול. כל 10 דקות להפוך את צינורות העיכול 10x עם תנועה אנרגטית (להימנע vortexing). להפסיק את העיכול כאשר השרירים מתחילים להשתחרר ומיוהים הסיבים גלויים. בסופו של דבר, זמן העיכול מטלטל את הדגימות. כדי לעצור את העיכול, להעביר בזהירות את השעיית העיכול לצלחת פטרי מראש 100 מ”מ עם 10 מ ל של פתרון כביסה.הערה: הימנע השריר על העיכול כמו זה יהיה באופן בלתי נמנע לגרום לבידוד של סיבי hyper-התכווץ. בדרך כלל עם פרוטוקול זה, השרירים של עכברים homozygous מוטציה לקחת 45 דקות להיות מתעכל, בעוד השרירים של עכברים סוג פראי לקחת 50-55 דקות. זמן העיכול צריך להיות מאומת. סיבי בידוד ראשית לבודד את הסיבים כבר הנתק תחת מיקרוסקופ מבתר על ידי בחירת אותם בנפרד עם P200 מצופה הצינורות או חור קטן פסטר ולהעביר אותם 100 mm פטרי לתוך צלחת פטרי חדש 35 מ”מ עם 5 מ ל של פתרון כביסה מראש מחומם. כדי לשחרר עוד סיבים, פיפטה שריר למעלה ולמטה באמצעות חור גדול נשא פיפטה זכוכית עם בינוני חם, עד סיבים הם שוחרר מכנית. אל תהיה עקשן מדי כמו זה יגרום סיבים מזיקים. המשך לשחרר את הסיבים האלה מהשריר עד שהתבשיל מכיל כמות רצויה. אם צלחת פטרי נשמרת בטמפרטורת החדר עבור יותר מ 8 דקות, לעצור ולבצע מינימום של 5 דקות דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 כדי לשחזר את המדיום. לפני שהעבירו את הסיבים היחידים למדיום התרבותי, השאירו אותם ב 37 ° c, 5% CO2 בצלחת לשטוף לפחות 1 h. זה מסייע לסיבים להסתגל למצב של מבחנה .הערה: סיבים מיוניים רגישים פחות ללחץ וניתן לשטוף את ~ 2-3x. עם זאת, במצב זה (בגיל 19 ימים לאחר הלידה) עדיף לבצע רק אחד כביסה צעד כדי למנוע נזק מיוסיבי. לכן, תמיד לשים לב כדי לשמור על בחירה מיוסיבים מספיק נקי על ידי לא נושאת פסולת או סיבים היפרכווץ. תרבות אחת מיוסיבים העבר את הסיבים הבודדים לצלחת טרום-חמם חדשה עם מדיום התרבות המתאים (בינוני סרום גבוה כדי לאפשר הפעלה של תאי לווין, ראה איור 1). לשנות את המדיום לתוך סיבי מיוחים מבודדים, על ידי העברתו למנה מצופה חדשה עם מדיום התרבות החדשה, רק לאחר 48-72 h של התרבות כדי למנוע כל הלחץ שיוביל להפוך סיבים היפרציר והפרעה. 2. במטה יישומים: מיואוסיבים מרובי קישורים ומאימונולויונציה הערה: תאי הלווין המשויכים לאלה עשויים להיות מוודעים על-ידי immunofluorescence בזמן העניין. מכיוון שמרבית הפרוטוקולים המתפרסמים ממוטבים לביצוע IF בסיבים מבוגרים, כאן פרוטוקול מפורט מוצג כדי לקבל תוצאות אמינות גם על סיבים מיוקיים מבודדים מפני השרירים שלאחר הלידה. מיוסיבים מרובי קישור לפני תחילת ההכנות, הכינו את כל הפתרונות הנחוצים כמתואר בטבלה 2. Precoat עיל עם HS כמו רבים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות כמו מספר דגימות. הקפד להסיר את כל HS לפני שתמשיך. כיוון שסיבים מקושרים קשים יותר מאלה החיים וקשים יותר לפיפטה, הקפידו להצליב את הקשר בנוגע לסיבים 200-300 בנפרד לכל צינור. תחת מיקרוסקופ מבתר, לאסוף את כל הסיבים שיכולים להיחשב בריאים, להעביר אותם שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהשאיר את הצינור אנכית עבור 5 דקות בתוך החממה כדי לאפשר סיבים להתיישב. הסר את הסופרנטנט לאט מאוד מהצינור. Crosslink סיבים על ידי הוספת 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב RT לצינור. עשה זאת בעדינות כדי למנוע מצוקה בסיבים. כדי למנוע התחברות של סיבים במהלך הקשר, לשמור את הצינור בעצבנות עדין מאוד עבור 10 דקות. שמור את הצינור בעמדה אנכית עבור 5 דקות ב-RT כדי לאפשר לסיבים להתיישב, ואז למחוק את הסופרנטאנט להבטיח להסיר את רוב נפח החצי החצי. הוסף 1 מ ל של פוספט מתכלה מתכלה (PBS) ולשמור את הצינורות אנכית עבור 5 דקות ב-RT כדי לתת את הסיבים למשקע. הסר את הסופרנטנט וחזור על הליך הכביסה (שלב 2.1.8.) שוב פעמיים. המשיכו לעקוב אחר דגימות מקושרות ב-4 ° c.הערה: ניתן לשמור על הסיבים המקושרים ב -4 ° c במשך שבוע. אם הסיבים נותרים יותר משבוע במצב זה, הדבר יגרום באופן בלתי נמנע להיות מיוכן סיבים. אימונולווקורנציה שמור את הצינורות המכילים את הסיבים העומדים במצב RT עבור לפחות 5 דקות כדי לאפשר משקעי סיבים. הסר את הסופרנטאנט, משאיר רק אמצעי אחסון קטן כדי לוודא שלא תסיר סיבים. הוסף 1 mL של 0.5% טריטון X-100 ב PBS ו דגירה עבור 5 דקות עם עצבנות עדינה. לשים צינורות בתנוחה אנכית עבור 5 דקות, ולאחר מכן להסיר supernatant. הוסף 1.5 mL של PBS ו דגירה עם עצבנות עדינה עבור 5 דקות. לשמור על צינורות בתנוחה אנכית עבור 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. הוסף 1 מ ל של פתרון חסימה ו-מודטה עבור 1 h ב RT עם עצבנות עדינה. לשמור על צינורות 5 דקות במיקום אנכי, ולאחר מכן להסיר את supernatant. לדלל את הנוגדנים העיקריים בפתרון חסימה, להוסיף אותם לצינורות והדגירה מעל ללילה ב 4 ° צ’ בעצבנות עדינה (עבור ריכוזי הציע לראות את הטבלה של חומרים).הערה: לחלופין, את הנוגדן העיקרי ניתן מודבטים עבור 3 h ב RT. עם זאת, הדגירה לילה נתן כתמים אופטימליים. נפח הדגירה של הנוגדנים הן הראשי והמשני צריך להיות של 300 μL כאשר סיבי seמימדי להגיע לחריץ μL 100 של שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. כאשר סיבים הם פחות שופע, נפח של 100-200 μL מומלץ. השאר את הצינורות בתנוחה אנכית עבור 5 דקות ולאחר מכן הסר את הסופרנטאנט. לבצע 3 שוטף 1 מ ל של 0.25% רצף-20 ב-PBS, הדגירה 5 דקות עצבנות עדין ולאחר מכן עוזב את הצינורות עומד 5 דקות בכל פעם.הערה: מכאן והלאה, לבצע את כל השלבים בחושך, כדי למנוע fluorochromes הלבנת. לדלל נוגדנים משניים בפתרון חסימה, להוסיף אותם לצינורות והדגירה עבור 1 h ב RT עם עצבנות עדינה (עבור ריכוזים לראות את הטבלה של חומרים). לשטוף פעמיים ב 1 מ ל של 0.1% רצף-20 ב-PBS, הדגירה עבור 5 דקות עם עצבנות עדינה ולאחר מכן לעזוב את הצינורות בתנוחה עמידה עבור 5 דקות. הסר את הסופרנטאנט, הוסף 1 מ ל של פתרון DAPI ו דגירה עבור 5 דקות עם עצבנות עדינה. תן את הצינורות לעמוד אנכית בתוך מתלה עבור 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את הסופרנטאנט. לשטוף עם 1 mL של PBS, הדגירה עבור 5 דקות עם עצבנות עדין ולאחר מכן לעזוב את הצינורות לעמוד בארון למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטאנט, והשאיר כמות של כ-50 μL. הרכבה של בעלי תווית בעלת תוויות בעזרת שקופיות מיקרוסקופ חותכים טיפ P200 מהצנרת ומעילים אותו בתמיסה חוסמתהערה: כדי לחלוק את העצה, פיפטה את הפתרון למעלה ולמטה מספר פעמים לפני איסוף הסיבים, זה ימנע סיבים להיצמד לקיר קצה. לאסוף את הסיבים מהצינור ולפזר אותם על שקופית זכוכית מיקרוסקופ. תחת מיקרוסקופ מבתר, תוך שימוש רק באור הטבעי המשתקף על-ידי המראה, השתמש בטיפ חדש (לא לחתוך) P200-מיכל הפיפטה כדי להפיץ את הסיבים ולהסיר את התמיסה הנוזלית העודפת. השאר את השקופיות לאוויר יבש בחשיכה במשך כ-10-15 דקות, עד שיישאר כמות נמוכה של פתרון. הוסף את מדיום ההרכבה על השקופית (הכמות הנכונה של בינונית הרכבה יש לכייל על הממד של coverslip: עבור שקופיות 24 x 40 מ”מ, 20 μL הוא מספיק) ולאחר מכן להניח לאט לשים זכוכית כיסוי על האזור המכיל את הסיבים. להיזהר לא ליצור בועות בין המשקפיים. לחץ על הכיסויים כך הסיבים יהיה לשכב על תוכנית אופקית אחת. תקן את הסרבל באמצעות לק. אחסן את הדגימות ב -4 ° צ’ עד 4 שבועות. לרכוש את התמונות הרצויות של התווית המסומנים בעזרת פלואורוסקופים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.