عزلة وثقافة ميفيبر واحدة من نموذج مورين من ضمور العضلات إيمري-دريفوس في وقت مبكر بعد الولادة
Summary
هنا، نقترح طريقة للحصول بكفاءة على ألياف العضلات واحدة في المراحل التنموية المبكرة بعد الولادة من homozygous متحولة لامين Δ 8-11 نموذج الماوس، وهو نموذج شديد جدا لالتد وضمور العضلات Emery-Dreifuss (EDMD).
Abstract
يحدث ضمور العضلات Emery-Dreifuss المهيمن على الأوتوموم (EDMD) بسبب الطفرات في جين LMNA ، الذي يشفر اللامينات النووية من نوع A ، بروتينات الشعيرة الوسيطة التي تحافظ على المغلف النووي ومكونات النوكللوبلازم. أبلغنا مؤخرا أن هدر العضلات في EDMD يمكن أن يعزى إلى الاختلالات اللاجينية الجوهرية التي تؤثر على العضلات (الأقمار الصناعية) الخلايا الجذعية القدرة التجديدية. العزلة والثقافة من myofibers واحد هو واحد من أكثر الفسيولوجية السابقين vivo النهج لرصد سلوك الخلايا الفضائية داخل مكانتها، لأنها لا تزال بين الصفيحة القاعدية المحيطة الألياف وساركليما. ولذلك، فإنه يمثل نموذجاً تجريبياً لا يقدر بثمن لدراسة الخلايا الساتلية من مجموعة متنوعة من نماذج المورين. هنا، ونحن وصف طريقة إعادة تكييفها لعزل myofibers واحد سليمة وقابلة للحياة من عضلات hindlimb بعد الولادة(تيبياليس أنديرالي، اكستتوروم لونجوس، Gastrocnemius وسوليوس). بعد هذا البروتوكول، تمكنا من دراسة الخلايا الفضائية من لامين Δ 11-11 -/- الفئران، وهو نموذج EDMD مورين شديد، في 19 يوما فقط بعد الولادة.
نحن نفصّل إجراءات العزلة، وكذلك شروط الثقافة للحصول على كمية لا بأس بها من myofibers وذريتها المشتقة من الخلايا الساتلية المرتبطة بها. عندما تُزرع في عوامل النمو المتوسطة الغنية، تنشط الخلايا الساتلية المستمدة من فئران من النوع البري، وتتكاثر، وتفرق في نهاية المطاف أو تخضع للتجديد الذاتي. في homozygous Lamin Δ8-11 -/- فئران متحولة هذه القدرات تضعف بشدة.
هذه التقنية، إذا اتبعت بدقة، يسمح لدراسة جميع العمليات المرتبطة الخلية الساتلية المرتبطة myofiber حتى في المراحل المبكرة من النمو بعد الولادة والعضلات الهشة.
Introduction
الهيكل العظمي هو نسيج متمايز مع واحدة من أكثر قدرة ممتدة على تجديد بعد ممارسة الرياضة أو الصدمة1. ويرجع هذا السمة أساسا إلى وجود الخلايا الجذعية، ودعا الخلايا الفضائية بسبب موقعها المحيطي بين الصفيحة القاعدية والبلازما من myofiber2. خلال مرحلة ما بعد الولادة، تتكاثر الخلايا الساتلية وتتمايز تدريجياً، مما يساهم في نمو العضلات الهيكلية. مرة واحدة في مرحلة البلوغ، تدخل الخلايا الفضائية حالة هادئة قابلة للعكس، وعلى الصدمة الفسيولوجية أو المرضية، فإنها تنشط، تتكاثر وتفريق من أجل إصلاح العضلات التالفة3. وقد تم ربط عيوب في قدرة الخلايا الأقمار الصناعية للمرور بشكل صحيح من خلال هذه المراحل التجديدية المختلفة والخضوع للتجديد الذاتي بإهدار العضلات ، إما خلال الشيخوخة الفسيولوجية4،5،6 أو في الأمراض التنكسية العضلية ، مثل dystrophies العضلات7،8،9،10.
اثنين من الأساليب الثقافة الرئيسية موجودة لدراسة الخلايا الأقمار الصناعية السابق vivo: الثقافات ميوجيني الأولية من الخلايا أحادية النوى, ميكانيكيا وكيميائيا فصلت من العضلات كله11,12; أو ثقافة معزولة myofibers13،14،15،16،17،18،19،20. في الحالة الأولى، عملية عزل الخلايا الأقمار الصناعية ينطوي على التثاب من العضلات كلها المستخرجة من الماوس، والهضم الكيميائي، والترشيح وفرز الخلايا الفلورية المنشطة (FACS)21. هذا الإجراء، على الرغم من فعاليته في عزل الخلايا الفضائية من مجموعة متنوعة من النماذج، ينطوي على العديد من المتغيرات التي تعرض الخلايا الفضائية للإجهاد وتعطل مكانتها الفسيولوجية22،23. على النقيض من ذلك ، تتضمن عزل myofiber هضمًا ألطف للأنسجة العضلية مع الإنزيمات المهينة المصفوفية والتمزيق الميكانيكي الذي يسبب انخفاض الصدمة للخلايا الجذعية20. هذا النهج الثاني يسمح لاسترجاع أكثر كفاءة من الخلايا الفضائية قابلة للحياة، التي لا تزال تعلق جسديا إلى myofiber بهم بين لامينا القاعدية وساركليما، مما يسمح التحليل داخل المتخصصة الفسيولوجية الخاصة بهم19،20.
وقد اقترح العديد من البروتوكولات المختلفة خلال السنوات الماضية لعزل بشكل صحيح وفعال myofibers واحد من عضلات الهيكل العظمي. بالفعل في عام 1986 اقترح بيشوف بروتوكولا لعزل الألياف من Flexor Digitorum Brevis13 وفيما بعد، في عام 1995، روزنبلات وآخرون تعديل البروتوكول للحصول على فصل أكثر كفاءة من myofibers14. ومنذ ذلك الحين، اقترح العديد من الكتاب الآخرين إجراءات معدلة على العضلات الأخرى، مثل Extensor Digitorum لونجوس (EDL) وتيبياليس أنديرالي (TA)15،16،17،18،19،20، التي هي أطول ، حتى لو كانت أكثر هشاشة ، والعضلات14. ويمكن بعد ذلك myofibers معزولة تزرع على حد سواء في الالتصاق ، للسماح لتوسيع الخلايا الأقمار الصناعية المستمدة myoblasts ، أو في ظروف عائمة ، تصل إلى 96 ساعة ، لمتابعة ذرية المستمدة من الخلايا الأقمار الصناعية واحدة19 (الشكل 1). وتستخدم تركيزات متغيرة من المصل داخل الوسط ثقافة لتحريك تنشيط الخلايا الأقمار الصناعية، والانتشار و / أو التمايز، لدراسة قدرتها على العبور بشكل صحيح خلال هذه المراحل المختلفة1.
وصفنا مؤخرا آلية اللاجينية وراء استنفاد الأقمار الصناعية تجمع الخلايا الجذعية في نموذج الماوس من EDMD، و لامين Δ8-11 -/- الماوس7. منذ هذه الفئران عادة ما يموت بين 4-8 أسابيع من العمر24, بسبب فقدان العضلات الشديد, بذلت محاولة لالتقاط العيوب الجزيئية الكامنة في بداية مبكرة من المرض من خلال تركيز تحليلنا على تنمية العضلات بعد الولادة. تم عزل myofibers واحد العائمة واستزراع من نوع البرية ولامين Δ8-11 -/- متحولة7 19 يوما الفئران. في هذه المرحلة ، عيوب العضلات واضحة بالفعل ، ولكن الفئران لا تزال قابلة للحياة. ومع ذلك ، منذ جميع البروتوكولات المذكورة أعلاه لاستخراج myofibers واحد تم تحسينها لعضلات الهيكل العظمي للفئران الكبار ، كنا بحاجة إلى تكييفها لأغراضنا : الفئران الصغيرة جدا في فترة العمر والحجم ، وseofibers هشة جدا. وهكذا، فإننا نصف هنا إعادة التكيف من البروتوكول المقترح من قبل مختبر Rudnicki19 للحصول على عدد كبير من myofibers واحد قابلة للحياة من الفئران أثناء التنمية بعد الولادة ومن العضلات dystrophic شديدة، مثل تلك المستمدة من لامين Δ8-11 -/- الفئران24. الهدف النهائي من هذا النهج هو توفير إجراء موحد لدراسة الخلايا الجذعية المرتبطة بالعضلات المرتبطة بالميوفيبير في أي نموذج فأر آخر عندما تكون المراحل المبكرة من تطور ما بعد الولادة ذات أهمية ، أو في حالة نماذج الماوس التي تحمل أي مرض معين يجعل myofibers أكثر عرضة للإجهاد الميكانيكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل myofibers واحد سليمة هو وسيلة أساسية في مجال myogenesis عندما يكون الهدف الرئيسي هو لتوصيف الخلايا المستقلة قدرات تجديد الخلايا الجذعية داخل مكانة بهم، في ظروف صحية والمرضية. ومع ذلك، عندما تكون الدراسات الكيميائية الحيوية أو الجينومية ذات أهمية، قد تكون الخلايا الساتلية المعزولة في نظام مراقبة الأصول الأجنبية هي الخيار الأفضل.
عزلة myofibers واحدة تسمح لمتابعة السابقين vivo، ولكن في الطريقة الأكثر فسيولوجية، وديناميات جميع الخطوات الخلايا الساتلية واحدة تمر خلال تجديد العضلات، والتي هي: التنشيط، انقسام الخلايا (غير المتماثلة والمتناظرة)، والتمايز والعودة إلى حالة التجدد الذاتي. مرة واحدة يتم زراعة myofibers في ظروف عائمة، والخلايا القمر الصناعي واحد تنشيط وتوسيع تشكيل مجموعة من الخلايا، وكلها مستمدة من نفس الخلية الأقمار الصناعية. تحليل الفلورس المناعي لعلامات الانتشار أو التمايز أو التفعيل أو الجزع هو الأمثل لتحديد النسبة بين مراحل الخلية.
الخطوة الرئيسية في بروتوكول لدينا للحصول على myofibers قابلة للحياة وسليمة يمكن اعتبار تشريح العضلات السريع ولكن لطيف، عن طريق عزل الأوتار إلى وتر، لتجنب أي تلف العضلات. نصيحتنا هي استخدام مقص حاد فقط وملاقط حادة صغيرة والحد من إجراء تشريح العضلات بأكملها إلى عشر دقائق. عندما يكون من الصعب عزل العضلات الصغيرة جدا (أي EDL وTA)، فمن الممكن قطع لهم معا وتقسيمها في وقت لاحق باستخدام مقص غرامة قطع على طول الخطة الطولية التالية الألياف. هذه الاستراتيجية في نهاية المطاف تعطي myofibers أقل سليمة ، ولكن لن تكون قابلة للحياة للخطر. يجب أن يتم تنفيذ الشيء نفسه على عضلات كبيرة مثل Gastrocnemius لتسهيل عملية الهضم. تحسين وقت الهضم ، الذي يحتاج إلى التحقق التجريبي ، والحد الأدنى من التلاعب بالألياف المعزولة هما أيضا جانبان حاسمان للنتائج الإيجابية للتحليل اللاحق.
ميزة البروتوكول ذكرت هنا هو أنه يمكن تطبيقه على الفئران الصغيرة جدا (في العمر والبعد)، حتى عندما تكون عضلاتهم هشة للغاية. حتى لو لم يذكر أعلاه، فمن الممكن أن تتبع هذا البروتوكول من تشريح إلى ثم الثقافة قابلة للحياة myofibers لفترة أطول باستخدام الأطباق المغلفة بالغشاء الطابق السفلي18،19. من المهم أن نعتبر أن هذا الوضع يختلف تمامًا عن الحالة العائمة ، حيث تغيب محفزات الالتصاق ومحفزات القرب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أندريا بيانكي، والشبكة الإيطالية لللامينووباي وأعضاء المختبر على الدعم وجميع التعليقات البناءة. ونحن ممتنون لكيارا كورديغيليرلي للمساعدة الثمينة في المجهر confocal. يشكر المؤلفان الدكتورة بياتريس بيفرالي على مساعدتها في التقاط الصور للشخصيات. وقد تم دعم العمل المقدم هنا من قبل بلدي أول AIRC منحة ن. 18535، AFM-Telethon n. 21030، وزير الصحة الإيطالي n. GR-2013-02355413 وكاريبلو 2017-0649 إلى C.L. C.M. مدعوم بمنحة MY AIRC الأولى n.18993 و AFM-Telethon n. 22489.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
