Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées sous l’approbation éthique du Ministère italien de la santé et du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (autorisation n. 83/2019-PR). Les animaux ont été maintenus dans un établissement autorisé à l’hôpital San Raffaele, Milan, Italie (autorisation n. N. 127/2012-A). 1. Dissection musculaire et culture myofiber Préparation de l’équipement. Avant de commencer, préparer toutes les solutions nécessaires telles que décrites dans le tableau 1. Ces solutions doivent être préparées fraîchement. Nettoyez toutes les surfaces et les outils qui seront utilisés pendant la procédure avec 70% d’éthanol. Avant de commencer par le sacrifice des souris, effectuer le revêtement de 100 mm et 35 mm petri plats à l’aide de sérum de cheval (HS). Enrober tous les plats pour empêcher les myofibers de s’attacher au plastique. Envisagez d’utiliser un plat de 100 mm et quatre plats de 35 mm par souris. Après avoir enlevé l’excès de SH, conserver les plats enrobés dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. Remplissez-le ensuite d’une solution de lavage ou d’un milieu de culture (deux plats de 35 mm par souris).REMARQUE : Alternativement, une solution de 10 % de HS dans le milieu modifié de l’Aigle (DMEM) de Dulbecco peut être utilisée pour enrober les plats. Utilisez toujours des plats enrobés. Il est possible d’utiliser des plats de culture de différentes tailles, mais les petits plats Petri de dimension sont recommandés. Pour l’isolation des fibres, préparez des pipettes Pasteur stériles comme le montre la figure 2. Pour chaque souris préparer une pipette de forage grand trou pour la manipulation musculaire et la désagrégation mécanique (Figure 2A) et une pipette petit trou pour la sélection des fibres (Figure 2B). Couper chaque pipette en verre, éventuellement à l’aide d’un stylo diamant, sur la longueur désirée et les bords lisses de la pipette sur une flamme. Enrober chaque pipette en la mouillant brièvement avec du SH avant utilisation. Sacrifice de souris et dissection musculaire Préchauffer la solution de digestion à température ambiante pendant 10 min avant de commencer la procédure de dissection. Les tubes à fond rond FACS en polypropylène sont les contenants les plus appropriés à cet effet. Immédiatement avant le début de la récupération musculaire, sacrifier la souris selon la recommandation nationale appropriée IACUC. Mouiller son bas du corps avec 70% d’éthanol avant de couper la peau pour faciliter l’enlèvement des cheveux. Mettez la souris dans une position couchée sur un support de polystyrène recouvert de papier d’aluminium et coupez la peau à partir du milieu du dos longitudinalement et dans la direction des jambes. Retirez soigneusement la peau sans toucher les muscles et les tendons. Il est possible d’arracher toute la peau. Couper les deux pattes de la souris et procéder rapidement à la dissection.REMARQUE : S’il est plus confortable, il est possible de poursuivre la dissection sur l’ensemble de la souris, mais travailler sur la jambe permet plus de mobilité et de précision dans les coupes ultérieures. Fixer la jambe sur le support au niveau du pied à l’aide d’une broche et commencer à isoler les muscles squelettiques d’intérêt dans cet ordre: TA, EDL, Gastrocnemius et Soleus. Soulevez le tendon inférieur de TA avec une pince à épiler forte à hauteur de cheville et coupez-le, puis coupez-le avec des ciseaux fins tout autour du muscle TA à l’autre tendon au niveau de la rotule (Figure 3A). Transférer dans la solution de digestion. Soulevez le tendon inférieur de l’EDL et séparez-le des autres muscles en le tirant doucement vers le haut jusqu’à l’autre tendon. Coupez-le et placez-le dans la solution de digestion.REMARQUE : Étant donné que l’EDL peut être extrêmement petit à couper séparément de l’AT, ils peuvent être disséqués ensemble (figure 3B). Ensuite, si le muscle entier est trop grand, coupez-le en 2-3 morceaux à partir du tendon et en suivant les fibres dans une direction longitudinale (Figure 3C). Faire pivoter la jambe montrant les muscles du dos et fixer le pied à l’aide de la broche. Soulevez le tendon de l’Achille, Gastrocnemius se séparera automatiquement des autres muscles. Le tendon supérieur est à l’arrière de la rotule. Coupez-le et ajoutez le muscle à la digestion. Soulevez le tendon externe de la jambe (par rapport au corps) et obtenez le Soleus. Séparez-le doucement des autres muscles en faisant défiler sous la pince à épiler. Faites de même pour l’autre jambe (étapes de 1.2.7. à 1.2.11.). Digestion musculaire Incuber la solution de digestion contenant tous les muscles d’un bain d’eau à 37 °C pendant environ 45-50 min. Pendant la digestion, vérifiez régulièrement le muscle pour éviter la sur digestion. Toutes les 10 minutes inversent les tubes de digestion 10x avec un mouvement énergétique (éviter le vortex). Arrêter la digestion lorsque les muscles commencent à se desserrer et les myofibers sont visibles. À la toute fin du temps de digestion secouer les échantillons. Pour arrêter la digestion, transférer soigneusement la suspension de digestion dans une boîte de Pétri préchauffée de 100 mm avec 10 mL de solution de lavage.NOTE : Évitez la sur digestion musculaire car cela se traduira inévitablement par l’isolement des myofibers hyper-contractés. Habituellement avec ce protocole, les muscles des souris mutantes homozygotes prennent 45 min à digérer, tandis que les muscles des souris de type sauvage prennent 50-55 min. Le temps de digestion doit être validé expérimentalement. Isolement des myofibers uniques Isoler d’abord les fibres déjà dissociées sous un microscope à dissection en les choisissant individuellement avec une pipette P200 enduite ou un petit trou Pasteur et les transférer du Petri de 100 mm dans une nouvelle boîte de Pétri de 35 mm avec 5 mL de solution de lavage préchauffée. Pour libérer d’autres myofibers, pipette le muscle de haut en bas à l’aide d’un grand trou portait pipette en verre avec milieu chaud, jusqu’à ce que les fibres sont libérés mécaniquement. Ne soyez pas trop persistant car cela se traduira par des fibres dommageables. Continuer à libérer les myofibers du muscle jusqu’à ce que le plat contienne une quantité souhaitable. Si la boîte de Pétri est conservée à température ambiante pendant plus de 8 min, arrêtez-vous et effectuez une incubation d’au moins 5 min à 37 °C, 5 % de CO2 pour rééquilibrer le milieu. Avant de transférer les myofibères simples au milieu de culture, laissez-les à 37 °C, 5% de CO2 dans le plat de lavage pendant au moins 1 h. Cela aide les myofibers à s’adapter à l’état in vitro.REMARQUE : Les myoibers adultes sont moins sensibles au stress et peuvent être lavés ~ 2-3x. Cependant, dans cet état (à 19 jours d’âge postnatal), il est préférable d’effectuer seulement une étape de lavage pour empêcher des dommages de myofiber. Par conséquent, toujours faire attention à garder les myofibers sélectionnés suffisamment propre en ne transportant pas de débris ou de fibres hypercontractées. Culture myofiber unique Transférer les myoibers individuels dans un nouveau plat préchauffé avec le milieu de culture approprié (milieu sérique élevé pour permettre l’activation des cellules satellites, voir la figure 1). Changez le milieu pour les myofibers isolés, en les transférant dans un nouveau plat enrobé avec un nouveau milieu de culture, seulement après 48-72 h de culture pour éviter tout stress qui conduira à l’hypercontraction et la perturbation des myofibers. 2. Applications en aval : Myofibers crosslinking et immunofluorescence REMARQUE : Les cellules satellites associées aux myofibers peuvent être visualisées par immunofluorescence (IF) au moment de l’intérêt. Puisque la plupart des protocoles publiés sont optimisés pour effectuer la FI sur les myofibers adultes, ici un protocole détaillé est présenté pour obtenir des résultats fiables également sur les myofibers isolés des muscles postnatals. Myofiber crosslinking Avant de commencer, préparer toutes les solutions nécessaires décrites dans le tableau 2. Précoat avec HS autant de tubes de microcentrifuge de 1,5 mL que le nombre d’échantillons. Assurez-vous de supprimer tous les SH avant de procéder. Puisque les fibres croisées sont plus dures que les fibres vivantes et plus difficiles à pipette, assurez-vous de croiser environ 200-300 fibres séparément par tube. Sous un microscope de dissection, recueillir toutes les fibres qui peuvent être considérées comme saines, les transférer au tube de microcentrifuge et laisser le tube vertical pendant 5 min à l’intérieur de l’incubateur pour permettre aux fibres de s’installer. Retirer le supernatant très lentement du tube. Fibres crosslink en ajoutant 1 mL de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à RT au tube. Faites-le doucement pour éviter la détresse des fibres. Pour éviter l’entrelacement des fibres pendant le croisement, gardez le tube dans une agitation très douce pendant 10 min. Gardez le tube en position verticale pendant 5 min à RT pour permettre aux fibres de s’installer, puis jetez le supernatant en veillant à enlever la majorité du volume PFA. Ajouter 1 mL de saline tamponnée de phosphate (PBS) et garder les tubes verticaux pendant 5 min à RT pour laisser les fibres aux sédiments. Retirez le supernatant et répétez la procédure de lavage (étape 2.1.8.) deux fois à nouveau. Conservez les échantillons croisés à 4 °C.REMARQUE : Il est possible de conserver les myofibers croisés à 4 °C pendant une semaine. Si les fibres restent plus d’une semaine dans cet état, cela se traduira inévitablement par l’intersiment des myofibers. Immunofluorescence Gardez les tubes contenant les fibres debout à RT pendant au moins 5 min pour permettre la sédimentation des fibres. Retirez le supernatant, en laissant juste un petit volume pour être sûr de ne pas enlever toute fibre. Ajouter 1 mL de 0,5% de Triton X-100 en PBS et incuber pendant 5 min avec une légère agitation. Mettre les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirer le supernatant. Ajouter 1,5 mL de PBS et incuber avec une douce agitation pendant 5 min. Maintenir les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirer le supernatant. Ajouter 1 mL de solution de blocage et incuber pendant 1 h à RT avec une agitation douce. Garder les tubes 5 min en position verticale, puis retirer le supernatant. Diluer les anticorps primaires dans la solution de blocage, les ajouter aux tubes et incuber sur nuit à 4 °C dans une agitation douce (pour les concentrations suggérées voir Tableau des matériaux).REMARQUE : Alternativement, l’anticorps primaire peut être incubé pendant 3 h à RT. Cependant, l’incubation de nuit a donné la coloration optimale. Le volume d’incubation des anticorps primaires et secondaires devrait être de 300 μL lorsque les fibres sédimentées atteignent l’encoche de 100 μL du tube de microcentrifuge de 1,5 m L. Lorsque les fibres sont moins abondantes, un volume de 100-200 μL est recommandé. Laissez les tubes en position verticale pendant 5 min, puis retirez le supernatant. Effectuer 3 lavages en 1 mL de 0,25% Tween-20 en PBS, incuber pendant 5 min dans une agitation douce, puis laisser les tubes debout pendant 5 min à chaque fois.NOTE: À partir de maintenant, effectuer toutes les étapes dans l’obscurité, pour éviter le blanchiment des fluorochromes. Diluer les anticorps secondaires dans la solution de blocage, les ajouter aux tubes et incuber pendant 1 h à RT avec une agitation douce (pour les concentrations voir Tableau des matériaux). Laver deux fois en 1 mL de 0,1% Tween-20 en PBS, incuber pendant 5 min avec une légère agitation, puis laisser les tubes en position debout pendant 5 min. Retirer le supernatant, ajouter 1 mL de solution DAPI et incuber pendant 5 min avec une agitation douce. Laisser les tubes reposer verticalement dans un rack pendant 5 min, puis retirer le supernatant. Laver avec 1 mL de PBS, incuber pendant 5 min avec une légère agitation, puis laisser les tubes reposer dans une grille pendant 5 min. Retirer le supernatant, en laissant un volume d’environ 50 μL. Montage de myofibers fluorescents étiquetés sur des lames de microscope Couper une pointe de pipette P200 et l’enrober d’une solution de blocageREMARQUE : Pour enrober la pointe, pipette la solution de haut en bas plusieurs fois avant de ramasser les fibres, ceci évitera des fibres pour coller au mur de pointe. Recueillir les fibres du tube et les étaler sur une lame de verre microscope. Sous un microscope de dissection, en utilisant uniquement la lumière naturelle réfléchie par le miroir, utilisez une nouvelle pointe de pipette P200 (non coupée) pour répandre les fibres et pour enlever l’excès de solution liquide. Laisser sécher les lames à l’air dans l’obscurité pendant environ 10-15 min, jusqu’à ce que la très faible quantité de solution reste. Ajouter le support de montage sur la lame (la quantité appropriée de support de montage doit être calibrée sur la dimension du couvercle : pour un couvercle de 24 x 40 mm, 20 μL suffit) puis posez lentement un verre de couverture sur la zone contenant les fibres. Veillez à ne pas créer de bulles entre les verres. Appuyez sur le couvercle de sorte que les fibres seront couchés sur un plan horizontal unique. Fixer le couvercle à l’aide de vernis à ongles. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 4 semaines. Acquérir les images souhaitées de myofibers fluorescents étiquetés avec un microscope confocal.